Perfil de proteínas de superficie de la próstata

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1402 (2022) Citar este artículo

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Las vesículas extracelulares (EV) son mediadores de la comunicación intercelular y una clase prometedora de biomarcadores. Las proteínas de superficie de los vehículos eléctricos juegan un papel decisivo en el establecimiento de una conexión con las células receptoras y son objetivos putativos para los ensayos de diagnóstico. El análisis de las proteínas de la superficie puede, por lo tanto, iluminar las funciones biológicas de los vehículos eléctricos y ayudar a identificar biomarcadores potenciales. Desarrollamos una estrategia que combina espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) y ensayos de ligadura de proximidad (PLA) para identificar primero y luego validar las proteínas de superficie descubiertas en los vehículos eléctricos. Aplicamos nuestro flujo de trabajo para investigar las proteínas superficiales de pequeños vehículos eléctricos que se encuentran en el líquido seminal (SF-sEV). Identificamos 1014 proteínas de superficie y verificamos la presencia de un subconjunto de estas en la superficie de SF-sEV. Nuestro trabajo demuestra una estrategia general para el análisis profundo de las proteínas de la superficie de los vehículos eléctricos en pacientes y condiciones patológicas, desde la detección imparcial mediante HRMS hasta análisis dirigidos ultrasensibles a través de PLA.

Las vesículas extracelulares (EV) son nanopartículas de dos capas de lípidos secretadas por la mayoría de las células. Hay tres subgrupos principales de vehículos eléctricos, que se clasifican según su tamaño, biogénesis y densidad: (i) exosomas, (ii) microvesículas y (iii) cuerpos apoptóticos. Los exosomas son pequeños EV (sEV) con un tamaño que oscila entre 30 y 150 nm, que se generan por la gemación interna de los endosomas, que conducen a la producción de cuerpos multivesiculares (MVB). Los MVB finalmente se fusionan con la membrana plasmática y liberan su contenido de sEV en la matriz extracelular, así como en los fluidos corporales, donde se ha demostrado que los sEV desempeñan un papel fundamental en la comunicación intercelular1,2,3,4,5. Las microvesículas con un rango de tamaño de 100 a 800 nm y los cuerpos apoptóticos con un rango de tamaño de 200 nm a 5 μm se desprenden directamente de las membranas plasmáticas de las células viables y las que experimentan muerte celular programada, respectivamente6. Los sEV, así como las microvesículas y los cuerpos apoptóticos pueden mediar en el transporte intercelular para el suministro de cargas moleculares que contienen proteínas, lípidos, ARN pequeños y otras especies de ARN y fragmentos de ADN genómico1,7,8.

Estudios recientes han demostrado que el contenido de los EV difiere según su linaje celular y que, por lo tanto, reflejan las células de las que se originan. El análisis de la variación dinámica de las huellas dactilares de sEV puede proporcionar un medio valioso para rastrear y monitorear enfermedades9,10,11,12,13. Los estudios y ensayos moleculares actuales centrados en los biomarcadores circulantes evalúan principalmente el contenido de ARN y lípidos de los sEV circulantes, pero también hay un interés creciente en investigar la composición proteica de los sEV3. En particular, las proteínas de superficie de los vehículos eléctricos son de gran interés debido a su papel en el establecimiento de contacto con las células diana, lo que puede conducir a su captación celular o fusión con la membrana plasmática antes de la liberación de sus cargas moleculares14.

Las SEV del líquido seminal (SF-sEV), también conocidas como prostasomas, son secretadas por la próstata en el líquido seminal, donde una de sus funciones clave es interactuar directamente y proteger a los espermatozoides15,16,17. La fusión de las SF-sEV con la membrana plasmática del espermatozoide es necesaria para la regulación de diferentes aspectos de la función de los espermatozoides, como la motilidad y la capacitación, uno de los últimos pasos en la maduración de los espermatozoides necesarios para adquirir la capacidad fecundante18,19. Los SF-sEV también se han implicado en la interacción entre las células de cáncer de próstata y su microambiente20. Se reconocen como biomarcadores potenciales en la infertilidad masculina21 y el cáncer de próstata22,23, pero se sabe poco sobre los mecanismos celulares que conducen a su producción y las vías moleculares que impulsan las funciones de SF-sEV.

El análisis de proteínas basado en espectrometría de masas (MS) es una herramienta eficiente y ampliamente utilizada para caracterizar las proteínas de los EV24,25. Los datos generados por MS han contribuido al desarrollo de bases de datos en línea, como ExoCarta (www.exocarta.org)26 y Vesiclepedia (www.microvesicles.org), que enumeran las proteínas que se encuentran en los EV, incluidos los sEV27. Se han aplicado varias técnicas bioquímicas para el análisis basado en MS de proteínas de membrana con baja abundancia en EV28. En particular, se han implementado reactivos no permeables a la membrana para la derivatización química, como la sulfo-NHS-SS-biotina, para estudiar tanto las proteínas de la superficie celular29 como las proteínas de la superficie EV de las células de cáncer de páncreas30 y la línea de mastocitos HMC-131.

Sin embargo, las estrategias basadas en MS por sí solas no logran establecer la localización y orientación correctas de las proteínas en las superficies de los vehículos eléctricos. Por lo tanto, a menudo se requieren más experimentos de validación que apliquen métodos ortogonales32,33, como métodos de inmunoafinidad acoplados a microscopía electrónica y de superresolución34,35,36,37. En general, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y otros ensayos basados en afinidad se utilizan para detectar moléculas de superficie conocidas en vehículos eléctricos intactos. No obstante, estos métodos no son adecuados para investigaciones amplias y múltiples de proteínas de superficie, ya que solo se pueden interrogar dos proteínas diana por ensayo y los resultados pueden verse comprometidos por la unión no específica y la reactividad cruzada. Aunque las matrices de anticuerpos se han aplicado recientemente en diferentes formatos para la detección de grandes conjuntos de proteínas asociadas a EV38,39,40, debido al espectro limitado de reconocimiento de antígenos, no están adaptadas para el descubrimiento imparcial de proteínas EV clínica y biológicamente relevantes. a pesar de su capacidad de multiplexación y bajos requisitos de muestra.

En este estudio, desarrollamos un flujo de trabajo para el descubrimiento y validación de proteínas de superficie EV desconocidas mediante la combinación de análisis MS de alta resolución (HRMS) de proteínas de superficie derivadas de biotina con ensayos de ligadura de proximidad basados en citometría de flujo (Exo-PLA) y/o ensayos de ligadura de proximidad en fase sólida (SP-PLA) (Fig. 1). La citometría de flujo es una técnica robusta para medir marcadores de células de superficie y una herramienta que se utiliza de forma rutinaria para el perfilado de células en la práctica clínica41,42. Esta técnica también se presta a análisis de arreglos de cuentas43,44. La posibilidad de distinguir subpoblaciones de EV hace que la citometría de flujo sea particularmente atractiva para la investigación de sEV; sin embargo, debido a su pequeño tamaño y al bajo número de moléculas de superficie, las oportunidades para utilizar la citometría de flujo convencional siguen siendo limitadas. El uso de Exo-PLA, una tecnología de amplificación de señal y detección multicolor, hace posible superar las limitaciones de tamaño y señal para el análisis de citometría de flujo de sEV. De hecho, aprovechando la amplificación de la señal local a través de la amplificación de círculo rodante (RCA), los sEV individuales se vuelven detectables muy por encima del límite de citometría de flujo. Mediante el uso de diferentes aglutinantes de afinidad, como anticuerpos, y varios tintes fluorescentes, se pueden visualizar y enumerar diferentes subpoblaciones de sEV45,46. SP-PLA se basa en el reconocimiento del objetivo mediante conjuntos combinados de tres anticuerpos, con lecturas a través de PCR en tiempo real, lo que proporciona una excelente sensibilidad y especificidad para la detección de sEV en solución23.

Se aislaron SEV de fluidos seminales humanos y medios de cultivo PC3, respectivamente, y se trataron con sulfo-NHS-SS-biotina para biotinilar las proteínas de la membrana externa en la superficie de los sEV antes de agregar el tampón de lisis. Las proteínas de superficie biotiniladas se capturaron en perlas de estreptavidina y se liberaron mediante DTT. b Las proteínas totales, totales menos de superficie y de superficie se digirieron e identificaron mediante análisis HRMS semicuantitativo sin etiquetas. c La presencia de estas proteínas fue validada por Exo-PLA y SP-PLA.

Aplicamos este flujo de trabajo para investigar los SF-sEV como determinantes esenciales de la fertilidad masculina y posibles biomarcadores de cáncer. En este estudio, buscamos expandir nuestro conocimiento actual sobre las proteínas de superficie de los SF-sEV, lo que nos permitió evaluar su función biológica e identificar y clasificar los SF-sEV a nivel molecular con fines de diagnóstico.

Los SEV del líquido seminal humano (SF-EV) y de la línea celular de cáncer de próstata PC3 se purificaron de acuerdo con protocolos optimizados que coincidían con cada matriz47. El procedimiento involucró una combinación de ultracentrifugación, cromatografía de exclusión por tamaño y separación en gradiente de sacarosa. La calidad de las vesículas purificadas se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) con tinción negativa, transferencia Western y análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) según lo recomendado por las pautas de información mínima para estudios de vesículas extracelulares (MISEV) 201848. La tinción negativa EM reveló SF-sEV y PC3 sEV estructuralmente intactos (Fig. 2a). Se realizó un análisis de transferencia Western para demostrar la presencia de los marcadores sEV CD9, CD63, CD81 y la proteína del gen 101 de susceptibilidad tumoral (TSG-101), y la ausencia del marcador calnexina del retículo endoplásmico (ER), lo que indica la pureza de las muestras sEV de contaminaciones de proteínas (Fig. 2b). NTA reveló un diámetro de partícula promedio de 190 y 160 nm para SF-sEV (es decir, de líquido seminal) y PC3 sEV, respectivamente, con una concentración media de 1,3 × 109 partículas/ml y 1,4 × 109 partículas/ml, respectivamente (Fig. 2c).

a EM teñido negativo de SF-sEV y PC3 sEV. b Resultados de Western blot para los marcadores sEV TSG-101, CD63, CD81 y CD9. El marcador ER calnexina se eligió como control negativo. c El análisis NTA del diámetro de partícula modal registró valores de 155,8 y 192,2 nm para SF-sEV y PC3 sEV, respectivamente. d La calidad de la purificación se evaluó mediante electroforesis en gel para PC3 sEV y SF-sEV Repl 2 y Repl 3. A: Total menos fracción de superficie PC3 sEV; B: Total menos fracción de superficie SF-sEVs Repl 2; C: Total menos superficie SF-sEVs fracción Repl 3; D: superficie SF-sEVs fracción Repl 2; E: fracción de superficie SF-sEVs Repl 3; F: Fracción superficial PC3 sEVs.

Las proteínas de superficie de SF-sEV intactos y PC3 sEV se marcaron con sulfo-NHS-SS-biotina, un reactivo impermeable a la membrana que reacciona con aminas primarias30. Las fracciones obtenidas del proceso de purificación fueron: (i) proteína en lisado de sEV total (Total); (ii) proteínas aisladas de superficies sEV (Superficie) y (iii) proteínas sobrenadantes que quedan después del aislamiento de proteínas de superficie (Total menos Superficie) (Figs. 1a y 2d). Las proteínas de cada fracción fueron digeridas por tripsina y analizadas por HRMS (Fig. 1b). Se preparó un lisado de células PC3 total y se analizó como control. En Datos complementarios 1 se informa una lista completa de proteínas identificadas en todas las fracciones para SF-sEV, PC3 sEV y PC3. Para todas las proteínas identificadas en este estudio, la tabla en Datos complementarios 1 informa: 1- Ontología génica ( GO) anotación; 2- localización; 3- participación en procesos biológicos y 4- función molecular, y proporcionamos una anotación sobre la especificidad del tejido y las vías utilizando datos descargados de la base de datos UniProt Knowledgebase (UniProtKB). Se confirmó que las proteínas de superficie aisladas identificadas por HRMS se expresaban en las superficies de sEV usando Exo-PLA y SP-PLA (Fig. 1c). La calidad de la purificación de sEV se evaluó mediante electroforesis en gel (Fig. 2d). Además, para evaluar la solidez de nuestro flujo de trabajo, preparamos y analizamos las muestras de SF-sEV en réplicas: (ver "Métodos", Fig. 1a-c complementaria y Fig. 2b-g complementaria). El protocolo para la preparación de muestras demostró una baja variabilidad entre las réplicas (7–19 %). Al comparar réplicas técnicas para las mismas muestras biológicas (Rep. 2 y Rep. 3), se encontró que 1086 de un total de 1364 proteínas eran comunes para la superficie total menos (Figura complementaria 1b) y 653 de un total de 915 para la superficie ( Figura complementaria 1c). Cuando se compararon las réplicas técnicas y biológicas para la superficie total menos, se encontraron 41 proteínas en común para Rep 1 y Rep 2, y 64 en común entre Rep 1 y Rep 3 (Fig. 1b complementaria). Para la superficie Rep 1 frente a Rep 2, se identificaron 46 proteínas comunes, mientras que el número de proteínas compartidas para Rep 1 frente a Rep 3 fue 31 (Fig. 1c complementaria). Se encontró una alta correlación entre la abundancia relativa de proteínas en coincidencias espectrales de péptidos normalizados (nPSM) entre réplicas (r de Pearson: 0.84–0.99; Fig. 2 complementaria).

Después de fusionar las proteínas identificadas en las réplicas, el análisis de las fracciones lisado total, superficie y superficie total menos dio como resultado la identificación de 1414, 1014 y 1460 proteínas, respectivamente (Figura complementaria 1, Datos complementarios 1 y Figura 3b) . Como se muestra en la Fig. 3, se identificaron 875 proteínas en todas las muestras, 381 proteínas eran comunes entre el lisado total y la superficie total menos, y 20 y 39 proteínas eran comunes entre la superficie y la superficie total menos y el lisado total, respectivamente.

a Las proteínas identificadas por análisis MS de SF-sEV y PC3 sEV se compararon con las bases de datos ExoCarta y GO. b Representación del diagrama de Venn de las proteínas identificadas en las tres fracciones de SF-sEV. c Representación en gráfico circular de las categorías de componentes celulares de ontología génica (GO-CC) para proteínas enriquecidas en superficie total menos. d Categorías GO-CC para proteínas enriquecidas en fracciones de superficie. e Los diez términos principales obtenidos por análisis de anotación funcional en DAVID para proteínas enriquecidas en fracciones de superficie total menos. f Diez términos principales identificados en DAVID para proteínas enriquecidas en fracciones de superficie. Solo se incluyeron en el análisis las proteínas identificadas en al menos dos muestras.

Para realizar un análisis proteómico semicuantitativo en todas las fracciones de sEV de PC3 y líquido seminal, el número de coincidencias espectrales de péptidos (PSM) asociado con cada proteína identificada se normalizó de acuerdo con el número total de PSM identificados en cada muestra para obtener el nPSM. . Entre las cincuenta proteínas más abundantes identificadas en la fracción de superficie de los SF-sEV se encuentran semenogelina-1 (SEMG1), semenogelina-2 (SEMG2), fibronectina (FN1), CD13, CD10, ácido graso sintasa (FASN) y creatina quinasa B ( CKB). SEMG1 y SEMG2 fueron particularmente abundantes con valores de nPSM de 8.1 y 5, respectivamente (Tabla 1 y Datos complementarios 1). Nuestro análisis dio como resultado la identificación de 273 nuevas proteínas sEV putativas, actualmente no incluidas como proteínas sEV en la base de datos Exocarta ni en UniProtKB (Fig. 3a). La identificación de proteínas de superficie por medio del marcaje de proteínas usando sulfo-NHS-SS-biotina en sEV intactos no asegura una eficiencia del 100 % en la extracción de proteínas de superficie, y podría esperarse cierto grado de contaminación entre las fracciones. Por lo tanto, con el fin de identificar las proteínas más enriquecidas en cada fracción, se utilizaron estadísticas de clasificación de cambio de pliegue y prueba t. Las proteínas encontradas únicamente o más abundantemente en la fracción de superficie en comparación con las del total menos la fracción de superficie (cambio de veces (FC) >2 y/o valor P <0,05) se definieron como enriquecidas en la superficie. Las proteínas enriquecidas en la fracción superficial total menos en comparación con las de la fracción superficial se definieron como carga enriquecida. El análisis dio como resultado la identificación de 74 proteínas SF-sEV enriquecidas en la superficie, de las cuales 43 se clasificaron como proteínas de membrana según la clasificación de componentes celulares GO (Datos complementarios 1 y 2).

Las funciones y la red de 74 proteínas enriquecidas en superficie se analizaron utilizando STRING, una herramienta de búsqueda y una base de datos biológica para la detección de genes/proteínas y para la predicción de interacciones proteína-proteína (https://string-db.org/). Las proteínas se analizaron en base a siete criterios: (1) expresión en el citosol, (2) supuesta participación en el desarrollo de la enfermedad, (3) funciones en el sistema inmunitario, (4) cualquier supuesta función en el sistema reproductivo masculino, (5) presencia de proteínas en EV, (6) vesículas seminales y (7) cuerpo multivesicular. Las descripciones funcionales breves de estas proteínas se enumeran en los Datos complementarios 3 y el cumplimiento de uno o más criterios para cada proteína se ilustra en la Fig. 3 complementaria.

Las proteínas más enriquecidas en la fracción de superficie en comparación con la superficie total menos fueron KRT2, DNAJC3 y CASP14 (Fig. 4a, b, Datos complementarios 2; tres repeticiones). Los marcadores de sEV conocidos entre las proteínas más abundantes en la fracción de superficie de los SF-sEV fueron ANPEP, FASN y CLU (Fig. 4c).

a Las proteínas identificadas en la superficie y en fracciones totales menos superficiales se compararon mediante cambio de pliegue y análisis estadístico de prueba t. a El gráfico de barras representa la proporción de las 25 proteínas más enriquecidas en superficie y en fracciones de superficie total menos. b La gráfica del volcán representa los cambios de pliegue y el valor P para las proteínas identificadas al menos en dos muestras. c Abundancia de coincidencias de espectro de péptidos normalizados (nPSM) de marcadores de sEV conocidos en la fracción de superficie de SF-sEV.

Además, analizamos la localización subcelular, la función molecular y los términos GO del proceso biológico para las proteínas que encontramos que estaban enriquecidas en la superficie o en la carga (Datos complementarios 1). Tanto para SF-sEV como para PC3 sEV, el análisis de localización subcelular mostró un fuerte enriquecimiento en proteínas anotadas como extracelulares entre las proteínas que eran más abundantes en la fracción de superficie. Las proteínas asociadas con la región extracelular fueron el 3% de la fracción de carga, mientras que hasta el 13% de las proteínas en la fracción de superficie se anotaron como proteínas de superficie (Fig. 3c, dy Figs. Suplementarias 4 y 5). De manera similar, el análisis de los términos GO para funciones moleculares y procesos biológicos reveló rasgos específicos distintos para la superficie y las proteínas de carga (Fig. 4 complementaria), que se resumen en el análisis de anotación funcional realizado con la base de datos DAVID (Fig. 3e, f ). El análisis GO funcional reveló que los términos altamente enriquecidos para la fracción de superficie eran unión de calcio y filamento intermedio, mientras que citoplasma y acetilación eran los términos principales para las proteínas enriquecidas con carga. Los diez términos biológicos principales obtenidos por DAVID para cada categoría GO se enumeran en la Fig. 4 complementaria.

La presencia de las proteínas identificadas por MS en la superficie de los SF-sEV y PC3 sEV intactos se investigó más a fondo mediante el desarrollo de pruebas Exo-PLA o SP-PLA específicas. Exo-PLA visualiza sEV utilizando múltiples pares de sondas de anticuerpos. Cuando ambos miembros de un par de sondas se unen estrechamente entre sí en la superficie de los sEV, se puede generar físicamente una hebra de ADN circular, lo que da lugar a un producto RCA. A continuación, las secuencias repetidas del producto RCA se visualizan mediante sondas de hibridación, se marcan con tintes fluorescentes y se detectan mediante citometría de flujo. Esta poderosa herramienta permite la diferenciación molecular de las subpoblaciones de sEVs basándose únicamente en la combinación de proteínas expresadas en su superficie45. La estrategia de activación se explica en la figura complementaria 6a. Usamos una combinación de sondas Exo-PLA dirigidas a marcadores sEV conocidos y altamente expresados como controles y objetivos seleccionados identificados a través de nuestro análisis HRMS para confirmar la presencia de SEMG1, fosfatasa ácida prostática (ACPP), antígeno prostático específico (PSA), próstata- antígeno de membrana específico (PSMA), prostaglandina D2 (PTGDS), CD59, proteína de anclaje A-quinasa (AKAP4), proteína secretora rica en cisteína 1 (CRISP1) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa específica de testículo (GAPDS) en la superficie de SF-sEV y PC3 sEV (Fig. 5a). En particular, identificamos dos subpoblaciones distintas de SF-sEV que expresan SEMG1 con CD59 o con PSMA, mientras que para PC3 sEV, la expresión de SEMG1 y CD59 fue menos abundante. Una combinación de sondas Exo-PLA dirigidas contra SEMG1, PSMA y PTGDS reveló poblaciones doble y triplemente positivas para SF-sEV y PC3 sEV. Una combinación de conjugados de anticuerpos dirigidos contra SEMG1, GAPDS y AKAP4 identificó poblaciones doble y triplemente positivas en SF-sEV pero no en PC3 sEV (Fig. 5a), lo que confirma los datos de MS, donde se encontró la mayor abundancia de AKAP4. en la fracción con las proteínas de superficie de SF-sEV en comparación con la de PC3 sEV. También se encontraron poblaciones doblemente positivas de SEMG1 y ACPP y SEMG1 y CRISP1 tanto en SF-sEV como en PC3 sEV; sin embargo, las poblaciones triple positivas en SF-sEV parecen ser mucho menos abundantes en comparación con la población positiva para SEMG1 junto con PSMA y PTGDS o SEMG1 con AKAP4 y GAPDS. Como control adicional para las diferentes señales fluorescentes, las muestras también se examinaron mediante microscopía de fluorescencia para la visualización de productos RCA fluorescentes y la validación final (Fig. 6b complementaria).

a Combinación de diferentes marcadores en la superficie de los sEV detectados por Exo-PLA. Se muestra la activación de señales positivas en citometría de flujo y diferentes poblaciones. b Los SF-sEV fueron capturados por perlas recubiertas con anticuerpos para objetivos específicos identificados por análisis HRMS (CRISP1, AKAP4, GAPDS, SMG1 y PTGDS), indicados para cada panel y detectados con sondas PLA contra marcadores CD9 y CD26. El marcador abundante CD68 se usó como captura para el control positivo de los rendimientos del ensayo, el marcador ER calnexina se usó como anticuerpo de captura de control negativo. Los ejes x muestran la concentración de muestras en ng de proteína total por ml. Los ejes Y muestran las diferencias entre el ciclo de umbral para la lectura de PCR en tiempo real de las reacciones de SP-PLA para las muestras y el ciclo de umbral del control negativo (tampón de ensayo sin muestras). Las barras de error representan la desviación estándar (SD), cada muestra se analizó por triplicado.

El SP-PLA basado en inmunoafinidad ofrece la oportunidad de detectar y cuantificar sEV intactos dirigiéndose a hasta tres proteínas de superficie. En este entorno experimental, los SF-sEV se capturaron primero usando anticuerpos contra una de las proteínas objetivo CRISP1, SEMG1, PTGDS, AKAP4 o GAPS. Los SF-sEV capturados luego se detectaron usando un par de sondas de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos dirigidos contra los marcadores conocidos CD9 y CD26. Se registraron señales de detección más altas cuando los SF-sEV fueron capturados por anticuerpos dirigidos contra CRISP1, SEMG1 o PTGDS en comparación con los SF-sEV capturados por anticuerpos contra AKAP4 y GAPDS. No obstante, todos los objetivos fueron detectables de manera robusta en la superficie de los SF-sEV (Fig. 5b). Como era de esperar, un experimento de control negativo, usando un anticuerpo de captura dirigido al marcador ER calnexina, dio señales indetectables incluso a altas concentraciones de muestra (Fig. 5b). Los datos de SP-PLA coincidieron con los obtenidos por Exo-PLA, lo que respalda aún más la expresión superficial de las proteínas identificadas en los análisis de HRMS.

La información sobre la identidad de las proteínas expresadas en la membrana de los sEV puede ser valiosa para los procedimientos de diagnóstico y preparación. En este estudio, desarrollamos una estrategia de vanguardia para investigar las proteínas de la superficie de los sEV, mediante la combinación de perfiles imparciales utilizando HRMS con Exo-PLA45 y SP-PLA49 para validar la presencia de las proteínas identificadas en la superficie de los sEV intactos. . El uso de un enfoque de EM imparcial nos permitió identificar un total de 1730 proteínas en SF-sEV y PC3 sEV, de las cuales 273 no se habían informado previamente, proporcionando así una lista de objetivos potenciales para futuros estudios de SF-sEV circulantes y otros sEV. (Figura 3a).

La estrategia descrita en este documento proporciona un medio eficaz para estudiar las proteínas de la superficie celular, así como las proteínas de la superficie de los EV29. Este enfoque sirvió para identificar un total de 1014 proteínas de superficie putativas en SF-sEV, donde se encontraron 457 proteínas en las tres muestras replicadas y 730 en al menos dos réplicas (Fig. 1 complementaria). De las 1014 proteínas, nuestros datos identificaron 74 proteínas únicas que se encontraron únicamente enriquecidas en la superficie de los sEV en comparación con las fracciones de proteína de superficie total menos (Datos complementarios 1 y 2). Las proteínas identificadas en más de una muestra replicada preparada para cada fracción representan los descubrimientos más sólidos y razonablemente también las proteínas más abundantes en esa fracción. Sin embargo, aún incluimos los pasos de validación basados en PLA para tres proteínas que se encontraron en tres muestras repetidas (SEMGI, PTGDS y CRISP1), para una que se encontró en dos réplicas (AKAP4) y para una que se encontró en una sola réplica (GAPDS ).

Los SEV liberados por un determinado tejido o tipo de célula representan una población heterogénea de EV50. De hecho, se ha informado que los SF-EV seminales se originan a partir de varios tipos de células diferentes en el sistema reproductivo masculino51,52, lo que quizás contribuya a la expresión heterogénea de proteínas, así como a funciones heterogéneas. Un análisis proteómico global de los datos reveló que 74 proteínas de superficie estaban enriquecidas en proteínas extracelulares de SF-sEV (datos complementarios 2 y fig. 3), lo que coincidía con las observaciones anteriores de Webber y sus colegas53. Usando una matriz SOMAscan para la medición de proteínas, los autores demostraron que las proteínas que se considera secretadas por la próstata podrían, de hecho, estar presentes en la superficie de los vehículos eléctricos. Nuestros datos, que se centraron en la evaluación de las proteínas de la superficie de los sEV, por lo tanto, refuerzan la hipótesis de que algunas de las proteínas medidas en los biofluidos también pueden estar expuestas en la superficie de los sEV.

Dado que la expresión génica y la síntesis de proteínas en los espermatozoides se interrumpen antes del final de la espermatogénesis, se ha informado que los espermatozoides adquieren parte de las moléculas necesarias para sus funciones completas de los SF-EV, que se ha demostrado que transfieren proteínas esenciales mediante la fusión con el membrana plasmática54. La capacitación de los espermatozoides es un proceso donde la señalización de Ca2+ es crítica. Como plantearon la hipótesis de Park et al., los espermatozoides también pueden utilizar otros mecanismos, que no implican canales iónicos para la señalización de Ca2+55. Dichos mecanismos pueden depender de la fusión de la membrana de la célula espermática con SF-EV, que transportan los receptores y enzimas necesarios para la movilización de Ca2+. Anteriormente se ha demostrado que la transferencia de CD38 desde SF-EV al esperma puede desencadenar la liberación intracelular de Ca2+ del receptor de rianodina (53). De acuerdo con la hipótesis de Park, nuestros datos sugerirían que las proteínas que facilitan la unión de iones de calcio se encuentran entre las proteínas más enriquecidas en la fracción de superficie de los SF-sEV (Fig. 3f y Fig. 4 complementaria). Cinco proteínas de las 74 encontradas particularmente enriquecidas en la superficie de SF-sEV, CRTAC1, AGRN, GAS6, NUCB2, NUCB1 y FLG2, están anotadas en GO como proteínas de unión a calcio (Datos complementarios 1).

La identificación de una gran cantidad de proteínas en los SF-sEV, que también se sabe que se expresan en el sistema nervioso central (Datos complementarios 1) (como la isoforma 5C de cadena pesada de cinesina (KIF5C), proteína de membrana de vesícula sináptica VAT-1 , 14-3-3 proteína theta (YWHAQ), secuencia 1 amplificada de carcinoma de mama, factor de elongación 1-alfa 1 (EEF1A1) y proteína soluble en ácido cerebral 1 (BASP1)), o la presencia de proteínas altamente expresadas en el El epitelio prostático neuroendocrino (antígeno de células madre prostáticas (PSCA)) respalda el origen neuroendocrino previamente sugerido de los SF-EV y su conocido efecto potencial como neurotransmisores56,57. Sin embargo, en este estudio no se identificaron proteínas como el receptor CatSper55, la cromogranina B y el neuropéptido Y56.

Se seleccionó un subconjunto de las proteínas de superficie identificadas por HRMS para su validación utilizando métodos basados en anticuerpos capaces de detectar sEV intactos a través de proteínas de superficie expuestas externamente. PLA representa un ensayo molecular único y poderoso que brinda la capacidad de detectar combinaciones de proteínas co-localizándolas en proximidad usando dos o más sondas que consisten en anticuerpos conjugados con oligonucleótidos de ADN. Tal unión de sonda en proximidad puede generar plantillas de ADN para amplificación por PCR o RCA y amplificación de señal para detección/confirmación visual. Uno de los formatos PLA, 4PLA, se ha aplicado con éxito para demostrar niveles elevados de SF-sEV en plasma de pacientes con cáncer de próstata23. Por lo tanto, la combinación de los métodos Exo-PLA y SP-PLA brinda información complementaria y la oportunidad única para la identificación de proteínas de superficie que pueden ser el objetivo de los ensayos de diagnóstico. Mientras que SP-PLA permite la identificación de sEV purificados a partir de subpoblaciones de sEV mediante la identificación/validación de la composición de la superficie de la proteína, el ensayo Exo-PLA proporciona sensibilidad para la cuantificación de sEV de biofluidos.

Usando Exo-PLA, confirmamos la presencia de SEMG1, ACPP, PSA, PSMA, PTGDS, AKAP4, CRISP1 y GAPDS en la superficie de SF-sEV y PC3 sEV. PSA, ACPP y PSMA son bien conocidos por su papel en la fisiología de la próstata y como biomarcadores del cáncer de próstata. La presencia de PSA en la superficie de los SF-EV se ha informado previamente58, mientras que ACPP y PSMA, identificadas en este estudio, son proteínas integrales de membrana59, y PSMA solo se ha identificado en la membrana de los lisosomas60. Se sabe menos sobre SEMG1, AKAP4, CRISP1, GAPDS y PTGDS, que, hasta donde sabemos, no se ha informado previamente que estén localizados en la superficie de SF-sEV o cualquier otro sEV.

Se sabe que SEMG1 y 2 son componentes principales del coágulo de semen humano y del plasma seminal (20-40% del contenido de proteína)61,62. Los análisis de expresión de proteínas han revelado que SEMG1 se expresa principalmente en el epitelio glandular de las vesículas seminales y algunos estudios han demostrado su expresión en células de cáncer de próstata63,64. Yang y sus colegas ya han demostrado que estas proteínas son constituyentes integrales de SF-EVs25. SEMG 1 se ha encontrado en complejo con el CD52 soluble y anclado en glicosilfosfatidilinositol (GPI), y se ha formulado la hipótesis de que el CD52 anclado en GPI sirve como base para SEMG1 para anclar los espermatozoides para formar coágulos65, que luego se degradan por el PSA a permitir la motilidad de los espermatozoides. Estudios recientes encontraron una correlación negativa entre la motilidad de los espermatozoides y la proporción de espermatozoides unidos a SEMG66,67. Estos hallazgos sugieren que los espermatozoides libres pueden ser un parámetro relevante para la fertilización in vivo68.

Aunque no se sabía previamente que GAPDS, AKAP4 y PTGDS se expresaran en la superficie de los SF-EV, todos se identificaron como proteínas asociadas a la superficie de las células espermáticas69,70, ambas involucradas en la motilidad de los espermatozoides71,72 y la fertilización de los óvulos de los mamíferos73 . Por lo tanto, es plausible que SEMG1 y otras proteínas identificadas en nuestro estudio puedan transferirse de las células prostáticas y del epidídimo a la superficie de los espermatozoides para contribuir a habilitar y/o mejorar su función fisiológica.

El enfoque para aislar proteínas de superficie después del marcado con biotina puede tener algunas limitaciones. Primero, la eficiencia del marcaje con biotina, un proceso que depende de la disponibilidad de aminas primarias, puede variar entre las proteínas. En segundo lugar, una purificación con perlas recubiertas de estreptavidina puede ser parcial o incompleta, pero con una representación uniforme, con riesgo de unión no específica a las perlas74,75,76. Esta podría ser, por ejemplo, la razón por la que los marcadores generales sEV/SF-sEV, como PSMA1, CD9 y CD151, se detectaron en todas las fracciones analizadas (superficie, total menos superficie y lisado total), pero se enriquecieron en las fracciones de superficie (Fig. 4 y Datos complementarios 1). En tercer lugar, las proteínas de superficie identificadas pueden incluir algunas proteínas de la capa absorbente, conocidas como proteína corona, presentes en los fluidos corporales o medios de cultivo, que se unen a la superficie de los vehículos eléctricos, donde pueden realizar una función específica o convertirse en una fuente de contaminación proteica al estudiar. proteínas de membrana77,78.

Mediante el desarrollo de este ensayo, demostramos la viabilidad de medir proteínas de superficie y, en particular, las de SF-sEV, que pueden proporcionar objetivos potenciales para el desarrollo de nuevos ensayos de diagnóstico y la detección de cáncer de próstata23. Nuestros análisis pueden proporcionar la base para el desarrollo de herramientas de diagnóstico para la evaluación de la fertilidad masculina al proporcionar una pantalla molecular que investiga los mecanismos necesarios para que los espermatozoides se vuelvan completamente funcionales79. Nuestra investigación de las proteínas de superficie de SF-sEV descritas aquí presenta una prueba de concepto para un flujo de trabajo, que combina el poder del análisis proteómico de MS imparcial con PLA específicos para la identificación de proteínas de SF-sEV pero con una aplicación potencial a cualquier tipo de EV. SP-PLA ofrece la posibilidad única de cuantificar los vehículos eléctricos con alta sensibilidad y especificidad, mientras que Exo-PLA, que incluye análisis multiparamétrico y de vehículos eléctricos individuales, tiene el potencial de convertirse en una plataforma óptima para respaldar una investigación profunda del papel de los supuestos proteínas de superficie a través de pacientes y condiciones patológicas. Ambos ensayos tienen el potencial de ser directamente transferibles para aplicaciones clínicas.

El plasma seminal se recolectó en el Centro de reproducción del Hospital Universitario de Uppsala de acuerdo con las rutinas existentes y con la autorización de la Junta de revisión interna8. Las dos muestras anónimas de SF-sEV (muestras 1 y 2) analizadas en este estudio se obtuvieron cada una agrupando muestras de plasma seminal de 5 individuos. La recolección de la muestra fue aprobada por el Comité de Ética de la Universidad de Uppsala (Ups 01-367) y se obtuvo el consentimiento informado. Los SF-sEV se purificaron utilizando un protocolo optimizado para el aislamiento de sEV de fluidos seminales80. El plasma seminal humano se centrifugó a 3000 × g durante 10 min y luego a 10 000 × g durante 30 min a 4 °C para sedimentar los desechos. A esto le siguió una ultracentrifugación del sobrenadante a 100 000 × g durante 2 h a 4 °C. El sedimento que contenía EV se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna XK16/70 llena de gel Superdex 200 (GE Healthcare). Esto fue seguido por una separación de gradiente de densidad, donde los SF-sEV se recuperaron en el rango de densidad de 1,13 a 1,19 g/ml. La concentración de los SF-sEV purificados se ajustó a 2 mg/ml utilizando el ensayo de proteínas Pierce BCA (ThermoFischer Scientific) y se mantuvo a -80 °C hasta su uso.

La línea celular de cáncer de próstata humano PC3 (ATCC-CRL1435) se cultivó en medio RPMI 1640, complementado con L-Glu 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 μg/ml y suero bovino fetal al 10 % (FBS; Gibco, ThermoFisher Scientific, EE. UU.). Las células se cultivaron hasta una confluencia del 70-80 %, luego se reemplazó el medio con medio que contenía FBS empobrecido en EV al 10 % (System Bioscience, Palo Alto, CA, EE. UU.), y las células se cultivaron durante 48 h adicionales. Se retiraron las células y se recogieron los medios acondicionados mediante centrifugación a 300 × g durante 10 min. Los medios acondicionados se pasaron a través de filtros de 0,22 µm (Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, EE. UU.) para eliminar los restos celulares, seguidos de una ultracentrifugación (Beckman Coulter) a 112 000 × g durante 120 min en un rotor Tipo SW-28 para sedimentar los SEV. . El sobrenadante se eliminó con cuidado y el sedimento se resuspendió en 1 ml de PBS 1X enfriado con hielo, complementado con inhibidor de proteasa 1X (Complete Mini®, Roche, Basilea, Suiza). Luego, los sEV se cargaron en una columna de cromatografía y se separaron utilizando el mismo procedimiento descrito para SF-sEVs45. Las fracciones que contenían sEV se agruparon y ultracentrifugaron dos veces a 112 000 × g durante 120 min utilizando un rotor tipo SW-28. El sedimento de sEV resultante se resuspendió en 200 µl de PBS suplementado con inhibidores de proteasa y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Los sEV purificados se descongelaron y se resuspendieron en paraformaldehído (PFA) al 2 %. Se depositaron cinco µl de las muestras en rejillas recubiertas de carbono/Formvar durante 20 min. Las rejillas se lavaron 3 × 1 min con 1 × PBS, luego se incubaron con glutaraldehído al 1% durante 5 min, seguido de un paso de lavado de 8 × 1 min con agua destilada. Las muestras se tiñeron en una gota de solución de uranil-oxalato (pH 7,0) durante 5 min, luego se incubaron con acetato de uranilo al 4 % (pH 4,0) y metilcelulosa al 2 % durante 10 min en hielo, protegidas de la luz. El exceso de acetato de uranilo y metilcelulosa se eliminó mediante transferencia sobre papel de filtro. Las rejillas se secaron durante 5 a 10 min al aire y se examinaron mediante TEM, FEI Tecnai™ G2 (ThermoFisher Scientific, EE. UU.), operado a 80 kV.

El análisis de seguimiento de nanopartículas se realizó utilizando un sistema Nano Sight LM10HSB equipado para captura de video rápida y seguimiento de partículas para determinar las distribuciones de tamaño de vesícula. Cada muestra se diluyó 500 veces y se analizó en 5 ejecuciones cada vez durante 30 s, se registró con una velocidad de jeringa de 50 utilizando el nivel de cámara 10, el umbral de detección 8 y el tamaño de partícula mínimo esperado automático y la distancia de salto automático en el software analítico versión NTA paquete 3.0.

Volúmenes de 500 µl de SF-sEV y PC3 sEV, a una concentración de 2 mg/ml, se lavaron dos veces con PBS y se ultracentrifugaron a 112 000 × g, durante 120 min. El sedimento se resuspendió en PBS 1x complementado con inhibidores de la proteasa y se ultracentrifugó a 112 000 × g durante 120 min adicionales. Luego, los sedimentos se resuspendieron y se incubaron en 500 µl de PBS 1x (pH 8,0) complementado con inhibidores de proteasa y EZ-Link sulfo-NHS-SS-Biotin 1 mM (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) durante 30 min en hielo. La biotina sin reaccionar se inactivó añadiendo Tris-HCl a una concentración final de 50 mM y se incubó durante 15 min. Para eliminar la biotina libre, los SF-sEV biotinilados y los PC3 sEV se diluyeron en PBS y se ultracentrifugaron a 112 000 × g durante 120 min. Luego, los sedimentos se resuspendieron en tampón de lisis (urea 6 M, inhibidores de proteasas, n-octil-β-D-glucopiranósido (β-OG) al 1% en PBS) y se incubaron durante 1 h en hielo. Para mejorar la solubilización de proteínas, las muestras se agitaron cada 5 min durante 5 s durante el tiempo de incubación y luego se sonicaron durante 30 min. Los lisados se centrifugaron a 10 000 × g a 4 °C durante 10 min para eliminar los desechos. Se almacenó una fracción de los lisados (lisado total), mientras que el resto se diluyó 10 veces en PBS 1x suplementado con inhibidores de la proteasa, se dividió en tres tubos (cada tubo contiene 300 μg de sEV lisados totales) y se incubó con 5 mg de estreptavidina. perlas magnéticas (a la concentración de 10 mg/ml; Dynabeads MyOne™, Invitrogen) a temperatura ambiente (RT) con mezcla de extremo a extremo durante 60 min. Las perlas de estreptavidina que contenían proteínas de superficie biotiniladas se recolectaron luego usando un imán y se lavaron tres veces con 1x PBS que contenía inhibidores de proteasa, mientras que el sobrenadante que contenía las proteínas no biotiniladas (superficie total menos) se almacenó a -20 °C. Las proteínas se eluyeron de las perlas mediante una incubación de 60 min a temperatura ambiente en DTT 50 mM en PBS, con mezcla de extremo a extremo. Luego, las proteínas eluidas (superficie) se separaron de las perlas con un imán y se almacenaron a -20 °C. Las concentraciones de proteína total para todas las muestras se determinaron mediante Dot-it-Spot-it (Maplestone, Knivsta, Suecia) según las instrucciones del fabricante. Antes de proceder con HRMS, las calidades de las muestras se comprobaron mediante electroforesis en gel. Las muestras se diluyeron en tampón de muestra LDS 4x (Invitrogen), se cargaron en un gel Bis-Tris al 4–12 % (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se corrieron a 200 V durante 50 min. El gel se tiñó con tinción de plata (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las células SF-sEV, PC3 sEV y PC3 se lisaron en tampón RIPA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) complementado con inhibidores de proteasa, se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se secaron con el sistema de transferencia en seco iBlot2 (ThermoFisher Scientific) . Se usó tampón de bloqueo LI-COR TBS (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EE. UU.) para el bloqueo y la incubación de anticuerpos. Las proteínas se analizaron utilizando 1,3 µg/ml de anticuerpo anti-TSG101, 0,5 µg/ml de anticuerpo anti-CD9, 0,5 µg/ml de anticuerpo anti-CD81, 0,5 µg/ml de anticuerpo anti-CD63 y 0,1 µg/ml de anticuerpo anti-calnexina. que se detectaron usando 50 ng/ml de burro anti-ratón IgG IRDye 680LT o 75 ng/ml de burro anti-conejo IgG IRDye 800CW como anticuerpos secundarios y analizados usando el escáner Odyssey de LI-COR. Toda la información sobre los anticuerpos se enumera en la Tabla complementaria 1.

Las proteínas en la solución se redujeron, alquilaron y digirieron en el filtro con tripsina. Los péptidos secos se disolvieron en ácido fórmico al 0,1 % y se diluyeron antes de la inyección para cargar una cantidad igual de péptidos para cada muestra. Los péptidos se separaron en fase inversa en una columna nanoLC C18, aplicando un gradiente de 90 min y electropulverizando en línea a un espectrómetro de masas HRMS QE-Orbitrap (Thermo Finnigan). La espectrometría de masas en tándem se realizó aplicando disociación por colisión de mayor energía (HCD). La búsqueda de datos se realizó mediante el algoritmo Sequest, integrado en Proteome Discoverer 1.4 (ThermoFisher Scientific) en una base de datos FASTA Uniprot (Homo sapiens, revisado, publicado en mayo de 2019, 20421 entradas). Los parámetros de búsqueda se establecieron en Taxonomy: Homo sapiens; Enzima: Tripsina. La modificación fija fue Carbamidometilo (C), mientras que las modificaciones variables fueron Oxidación (M) y Desamidado (NQ). Los criterios de búsqueda para la identificación de proteínas se establecieron en al menos dos péptidos coincidentes y un nivel de confianza del 95 % por proteína.

Exo-PLA se realizó adaptando el protocolo publicado por Löf et al.45. Brevemente, una mezcla de anticuerpos de captura monoclonales de ratón anti-CD9, CD63 y dipeptidil peptidasa-4 (CD26) (Tabla complementaria 1), se inmovilizó a través de oligonucleótidos de ADN conjugados a oligonucleótidos inmovilizados en perlas magnéticas como se describió anteriormente. Se proporciona una lista de oligonucleótidos en la Tabla complementaria 246. Se usó una mezcla de los tres anticuerpos para maximizar la eficiencia de la captura de sEV. Se utilizaron varias sondas PLA (anticuerpos conjugados con oligonucleótidos) para analizar la composición de las proteínas de superficie de los sEV capturados. Exo-PLA da lugar a una señal cuando pares de sondas PLA muy próximas generan círculos de ADN que moldean la formación de productos RCA, que se pueden visualizar con oligonucleótidos marcados con fluoróforo. Aquí, una sonda PLA representaba una mezcla de anticuerpos dirigidos contra dos marcadores de superficie exosomales bien conocidos, neprilisina (CD10) y aminopeptidasa N (CD13), mediante el acoplamiento del mismo oligonucleótido de ADN a los dos anticuerpos. Se preparó una segunda sonda PLA acoplando el oligonucleótido de ADN homólogo por separado a anticuerpos contra los siguientes objetivos específicos de sEV para identificar subpoblaciones de sEV: ACPP, PSA, PSMA, PTGDS, AKAP4, SEMG1, GAPDS, CRISP1 y CD59 (Datos complementarios 1) . Los sEV marcados con los diferentes productos RCA se analizaron mediante citometría de flujo en instrumentos BD FACS Aria III o BD LSR Fortessa (BD biosciences). Las puertas para señales positivas en diferentes poblaciones se establecieron utilizando controles negativos que contenían todos los reactivos experimentales excepto los objetivos (SF-sEV o PC3 sEV). La estrategia de activación se explica en la figura complementaria 6a. Para cada reacción, se tomaron muestras de 1 µl de sEV marcados con productos RCA para el control mediante microscopía de fluorescencia. Las imágenes se adquirieron con un objetivo Plan-Apochromat de 40x, NA 1.3, en un microscopio Zeiss Axio Imager Z2 y una cámara digital Hamamatsu C11440.

SP-PLA se realizó como se describió previamente49,81 con algunas modificaciones. Brevemente, se acoplaron 25–35 µg de anticuerpo generado contra las siguientes proteínas a 5 mg de perlas magnéticas de epoxi Dynabeads M-270 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cat. No. 14301, ThermoFisher Scientific): Calnexin, TSG101, PTGDS, AKAP4, CD63, SEMG1 y CRISP1 (Tabla complementaria 1). Las dos sondas SP-PLA para la detección de los sEV diana se construyeron acoplando los oligonucleótidos SLC1 y SLC2 conjugados con estreptavidina (Tabla complementaria 2) a anticuerpos biotinilados contra CD26 y CD9, respectivamente, en una proporción de 1:1. Los SF-sEV y PC3 sEV se diluyeron en el tampón de ensayo (1 mM D-biotina, 0,1 % BSA, 0,05 % Tween-20, 100 nM cabra IgG, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, 5 mM EDTA en 1x PBS) en una dilución en serie de 10 veces, 100 µg/ml–100 pg/ml para SF-sEV y 70 µg/ml–70 pg/ml para PC3 sEV. Se aplicó una serie de diluciones de 10 veces de 20 µg/ml–20 pg/ml cuando se dirigía a CD63 en SF-sEV. Todas las muestras se analizaron por triplicado, se capturaron en 200 ng/µl de perlas acopladas con anticuerpos y se marcaron con 500 pM de cada sonda SP-PLA en un volumen de reacción de 50 µl de tampón de ensayo. La PCR en tiempo real se realizó en volúmenes de 25 µl de tampón de amplificación (tampón de PCR 1×, MgCl2 2,5 mM, Sybr Green 0,25×, cebador BioFwd 0,1 μM, cebador BioRev 0,1 μM, BioSplint 0,1 μM, ATP 0,08 mM, dNTP 0,2 mM ( con dUTP), 0,03 U/μl Platinum Taq ADN polimerasa, 0,01 U/μl T4 ligasa y 0,002 U/μl Uracil-DNA glicosilasa) en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 (Applied Biosystems) programado a 95 °C durante 10 min , seguido de 45 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min.

En este estudio, se analizaron un total de dos muestras anonimizadas de SF-sEV, cada una de las cuales se preparó agrupando muestras de plasma seminal de cinco individuos. Los valores de coincidencia de espectro de péptidos (PSM) se usaron para el análisis cualitativo y semicuantitativo. Sin embargo, los valores se transformaron normalizándolos al nPSM total. Los valores faltantes se trataron como faltantes no aleatorios (MNAR)82 y se sustituyeron con el valor de 0,05 (enfoque de imputación de valor único). El grado de enriquecimiento de las proteínas de superficie se calculó como la proporción de nPSM entre la superficie y el total menos las fracciones de superficie. Se calculó un valor promedio cuando las réplicas estaban disponibles. Las réplicas 1 y 2 de los lisados totales de SF-sEV (Figuras complementarias 1a y 2a) representaron réplicas tanto biológicas como técnicas (Rep1, de la muestra 1 y Rep2, de la muestra 2), mientras que las tres réplicas para superficie y superficie total menos incluyó una réplica biológica y dos réplicas técnicas: Rep 1, SF-sEV purificados de la muestra 1: Rep 2 y Rep 3: SF-sEV purificados de la muestra 2. La importancia de la proporción calculada se evaluó mediante la prueba t. La variabilidad entre repeticiones se calculó como [(número de proteínas identificadas de forma única para cada muestra/número total de proteínas) × 100]. El análisis y representación de datos se llevó a cabo utilizando el entorno R para el cálculo y la visualización estadística y el software GraphPad Prism (Graph Pad Software Inc.). Las proteínas identificadas se compararon con la base de datos Exocarta. El archivo para la anotación de proteínas enumerada en los Datos complementarios 1 se descargó de Uniprot (http://www.uniprot.org/uploadlists/). Se utilizó la base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado Bioinformatics Resources 6.8, NIAID/NIH y el sistema de clasificación PANTHER83 para la anotación de Gene Ontology (GO) de las proteínas enriquecidas en las diferentes fracciones (ratio ≥2, número de repeticiones ≥2 ). Los datos de Exo-PLA se analizaron con el software BD FACS Diva 8.0 (BD biosciences). Para SP-PLA, todas las muestras se analizaron por triplicado y los datos se analizaron con el software Microsoft Excel. La figura 1a se generó manualmente con el software Inkscape.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE84 con el identificador de conjunto de datos PXD037791. Los datos fuente subyacentes a las Figs. 3, 4 y Figs. complementarias. 1, 2, 4, 5 se proporcionan en los Datos complementarios 1. Los datos de origen subyacentes a la Figura complementaria 3 se proporcionan en los Datos complementarios 2. Las imágenes de transferencia Western sin recortar y sin editar están disponibles como la Figura complementaria 7.

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Agradecemos a las instalaciones de Proteómica y BioVis basadas en espectrometría de masas de la Universidad de Uppsala por su asistencia y al Dr. Ahmed Ibrahim por su ayuda con la NTA. Este trabajo fue apoyado por SciLifeLab, Consejo Sueco de Investigación bajo las subvenciones 2020-02258, 2017-04152, 2018-02943, 2018-06156, 2018-02806 y 2015-4870, Torsten Söderbergs Stiftelse bajo la subvención M130/16, cáncer de próstata sueco Federación, Exodiab, la Fundación Sueca del Cáncer, las Fundaciones de Investigación del Cáncer de Radiumhemmet y la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica bajo la subvención SB16-0046. Los financiadores no tuvieron ningún papel en ninguna parte de este estudio.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Uppsala.

Los siguientes autores contribuyeron igualmente: Ehsan Manouchehri Doulabi, Claudia Fredolini.

Departamento de Inmunología, Genética y Patología, Laboratorio de Ciencias para la Vida, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia

Ehsan Manouchehri Doulabi, Claudia Fredolini, Radiosa Gallini, Liza Löf, Qiujin Shen, Ryoyo Ikebuchi, Alireza Azimi, Ulf Landegren y Masood Kamali-Moghaddam

Investigador en el extranjero de JSPS, Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, Tokio, Japón

Ryoyo Ikebuchi

Departamento de Ciencias Médicas, Química Clínica, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia

Louise Dubois y Anders Larsson

Centro de Descubrimiento e Innovación, Hackensack Meridian Health, Nutley, NJ, EE. UU.

olivier loudig

División de Inmunología y Alergia, Departamento de Medicina, Karolinska Institutet, Solna, Suecia

susanne gabrielsson

Departamento de Química-BMC, Química Analítica, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia

jonas bergquist

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MKM, EMD, UL, CF y JB concibieron la idea y planificaron el estudio. EMD, AA, QS, AL, OL y LD participaron en la producción y purificación de vehículos eléctricos. EMD y CF llevaron a cabo experimentos de enriquecimiento de proteínas. RG planeó y llevó a cabo experimentos de Western blot y SP-PLA y análisis de datos. JB fue responsable del análisis de MS. CF planificó y llevó a cabo el análisis de datos de los datos de MS. EMD y SG ayudaron con NTA. EMD, RI y LL llevaron a cabo experimentos de microscopía electrónica y Exo-PLA y análisis de datos con la ayuda de AACF, EMD, RG y LL escribieron el artículo con la supervisión de MKM Todos los autores contribuyeron a la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Masood Kamali-Moghaddam.

Ulf Landegren es accionista de Navinci y Olink Proteomics, con derechos sobre la tecnología PLA. Otros autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Eve Rogers. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Manouchehri Doulabi, E., Fredolini, C., Gallini, R. et al. Perfiles de proteínas de superficie de vesículas extracelulares derivadas de próstata mediante espectrometría de masas y ensayos de proximidad. Commun Biol 5, 1402 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04349-x

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Recibido: 25 mayo 2021

Aceptado: 08 diciembre 2022

Publicado: 22 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04349-x

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