La microfluídica de afinidad permite una alta

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1147 (2022) Citar este artículo

1291 Accesos

2 Altmetric

Detalles de métricas

La degradación de proteínas mediada por la vía ubiquitina-proteasoma regula los eventos de señalización en muchas condiciones fisiológicas y patológicas. Los ensayos de degradación in vitro han sido fundamentales para comprender cómo se regulan la proliferación celular y otros procesos celulares fundamentales. Estos ensayos son directos, de tiempo específico y muy informativos, pero también laboriosos, y normalmente se basan en electroforesis en gel de poliacrilamida de bajo rendimiento seguida de autorradiografía o inmunotransferencia. Presentamos la degradación de proteínas en chip (pDOC), una tecnología microfluídica integrada basada en MITOMI para el descubrimiento y análisis de la degradación de proteínas en extractos libres de células. La plataforma alberga cientos de microcámaras en las que se analiza la degradación de proteínas de forma rápida, simultánea y utilizando cantidades mínimas de reactivos en uno o varios entornos fisicoquímicos. Esencialmente, pDOC proporciona una alternativa múltiplex sensible al ensayo de degradación convencional, con relevancia para la investigación biomédica y traslacional asociada con la proteólisis regulada.

La degradación de proteínas por el sistema ubiquitina-proteosoma es un módulo regulador central a través del cual el nivel de proteínas en todas las células eucariotas permanece equilibrado. La desviación de la cantidad deseada de cada proteína en un momento dado puede ser perjudicial para la célula, dando lugar a tejidos disfuncionales y una amplia gama de enfermedades en humanos, incluido el cáncer, la fibrosis quística y los trastornos neurodegenerativos1,2.

La cascada central subyacente a la ubiquitinación involucra tres enzimas: la enzima E1 se une covalentemente y activa la molécula de ubiquitina para transferirla a una enzima de conjugación E2. Luego, el E2 conjugado con ubiquitina interactúa con una enzima ubiquitina-ligasa E3, que cataliza la transferencia de moléculas de ubiquitina desde el E2 a la proteína diana, generalmente a través de un enlace isopeptídico con un residuo de lisina. Los eventos de ubiquitinación repetitivos pueden formar una o más cadenas de restos de ubiquitina en la proteína diana (es decir, poliubiquitinación). Una cadena de poliubiquitina que es reconocida por el proteasoma desencadena la degradación de proteínas1,2. Cientos de enzimas E3 diferentes gobiernan el enorme alcance funcional y la especificidad de todo el proceso de ubiquitinación. Con respecto a la proliferación celular y la regulación del ciclo celular, el complejo/ciclosoma promotor de anafase de ubiquitina ligasa (APC/C) y el complejo proteico Skp1-Cullin-F-box (SCF) son particularmente importantes3,4,5. La especificidad de sustrato de ambos complejos depende de los coactivadores: Cdc20 y Cdh1 para APC/C y una de varias proteínas de caja F para SCF, por ejemplo, Skp2 y β-TrCP6,7,8. En general, la proteólisis ordenada mediada por las enzimas E3 reguladas por el ciclo celular asegura un ciclo celular unidireccional en todos los eucariotas6,7,8,9,10.

Mientras que algunas formas de cadenas de ubiquitina marcan las proteínas para su degradación por el proteasoma, la monoubiquitinación y otras formas de poliubiquitinación regulan las cascadas de señalización a través de vías independientes del proteasoma11. Además, la ubiquitinación puede ser revertida por enzimas llamadas deubiquitinasas de una manera que puede prevenir la proteólisis12. Por otro lado, es posible que la degradación proteasomal no siempre se acompañe de la ubiquitinación13. Por lo tanto, la degradación de proteínas no puede deducirse de la ubiquitinación y debe determinarse directamente.

Los ensayos de degradación de proteínas en extractos libres de células, también conocidos como "sistemas libres de células", han sido fundamentales en la investigación de biología celular, permitiendo análisis directos y cuantitativos de la proteólisis mediada por ubiquitina en entornos fisiológicamente relevantes. De hecho, gran parte de los principios del ciclo celular se descubrieron al monitorear la degradación de las proteínas del ciclo celular en extractos de huevos de rana o células humanas en ciclo (ver por ejemplo 14,15,16,17,18,19,20). El uso extensivo de estos 'ensayos de degradación' en la era moderna de hoy es un testimonio de su eficacia (ver por ejemplo 21,22,23). Curiosamente, los ensayos de degradación convencionales nunca se han beneficiado realmente de las tecnologías modernas y aún dependen de la electroforesis en gel, la autorradiografía o la inmunotransferencia y una gran cantidad de material biológico.

Los microfluidos integrados y las microválvulas neumáticas allanaron el camino hacia los chips de proteínas en los que las proteínas ordenadas se expresan recientemente en lisados ​​de reticulocitos que mantienen el plegamiento y la actividad adecuados de las proteínas24. Las proteínas diana se expresan en el chip o externamente y, posteriormente, se inmovilizan en microcámaras a través de una química de superficie designada. Luego, se puede realizar un gran panel de ensayos fluorométricos en miles de microcámaras, utilizando cantidades mínimas de reactivos. En los últimos años, hemos desarrollado varias aplicaciones basadas en el atrapamiento inducido mecánicamente de interacciones moleculares (MITOMI), para el análisis multiplexado in situ de modificaciones postraduccionales (PTM) de proteínas e interacciones no covalentes24,25,26,27,28,29,30.

La combinación de microfluidos integrados, matrices de proteínas y sistemas libres de células tiene un gran potencial en la investigación biomédica. En este estudio, demostramos una plataforma basada en MITOMI para la detección y cuantificación de la degradación de proteínas en extractos sin células. El método, llamado 'pDOC' (degradación de proteínas en chip), proporciona una alternativa multiplex rápida al método clásico mediante el cual la proteólisis mediada por proteasoma se ha analizado in vitro casi invariablemente durante casi medio siglo.

El vector pCS2-Flag-FA se generó hibridando oligos de etiqueta Flag y ligando el fragmento final en el vector pCS2-FA usando sitios de enzimas de restricción (RE) BamHI y FseI. Los plásmidos variantes pCS2-Flag-FA-Securin-GFP wt y ∆64 se generaron clonando wt o ∆64 Securin-GFP27 en el vector pCS2-Flag-FA, utilizando cebadores flanqueados FseI (5') y AscI (3'). Se ha descrito el plásmido pCS2-FA-Geminin-GFP27. pCS2-FA-Geminin∆27-GFP se generó amplificando el marco de lectura abierto (ORF) de Geminin-GFP comenzando en el codón para Metionina 28 usando cebadores flanqueados FseI (5') y AscI (3'). El producto de la PCR se volvió a clonar en el vector pCS2-FA. Los plásmidos pCS2-Flag-FA-Geminin-GFP wt y ∆27 variant se generaron mediante la clonación de cada una de las dos variantes de Geminin-GFP en el vector pCS2-Flag-FA utilizando los sitios FseI y AscI RE. El fragmento Flag-p27-myc se generó mediante una PCR de ensamblaje de dos pasos utilizando la plantilla pCS2-Flag-FA-p27-GFP, un primer conjunto de cebadores que contenía una etiqueta Flag (5') y una etiqueta Myc (3'), y una segundo conjunto de cebadores que contiene un promotor T7 (5') y una secuencia terminadora de T7 (3'). El extremo N de geminina (110 aminoácidos) unido a Azami-Green monomérico (mAG) se amplificó utilizando una plantilla descrita previamente31 y un conjunto de cebadores flanqueado con sitios RE FseI (5') y AscI (3'). El producto de la PCR se clonó en el plásmido pcS2FA-FLAG. Este último se utilizó como plantilla para generar una variante ∆27 mediante mutagénesis (kits QuikChange® Lightning de Agilent; 210513). Las sustituciones de K a A y de RxxL a GxxV (código de un solo aminoácido) se generaron mediante mutagénesis. Consulte la Tabla 1 complementaria para obtener más detalles. Además de mAG-Geminin, todas las proteínas etiquetadas con GFP portaban una variante mejorada de proteína verde fluorescente (eGFP). Consulte la Tabla complementaria 1 para conocer las secuencias de oligo.

Las células NDB se basan en la línea celular HEK293. Una descripción detallada de este sistema de celdas se puede encontrar en la ref. 17. Las células NDB y HeLa S3 (ATCC; #CCL-2.2) se mantuvieron en placas de cultivo de tejidos que contenían medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10 %, L-glutamina 2 mM y solución de penicilina-estreptomicina al 1 %. (Industrias biológicas; #01-055-1A, #04-001-1A, #03-020-1B, #03-031-1B). Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía CO2 al 5 %. Las células HeLa S3 se cultivaron en placas o en matraces giratorios de vidrio de 1 l en suspensión (80 rpm). Las células NDB se cultivaron en presencia de 5 μg/ml de blasticidina (Life Technologies; #A11139-03) para mantener el plásmido pcDNA6/TR que lleva el ORF para el represor Tet.

Para la sincronización de la mitosis tardía, se cultivaron células NDB en placas de 150 mm/diámetro. Después de alcanzar una confluencia de alrededor del 75 %, las células se trataron con 1 μg/ml de tetraciclina (Sigma-Aldrich; #87128) durante 22 h y se recolectaron para la preparación del extracto. Para la sincronización de la fase S, las células HeLa S3 se cultivaron en suspensión durante 72 h hasta una concentración de aproximadamente 5 × 105 células/ml. Luego, las células se complementaron con timidina 2 mM durante 22 h, se lavaron con DMEM (dos veces, 5 min, 250 × g) y se liberaron en medios frescos precalentados (37 ° C) durante 9 h adicionales. Luego, el cultivo celular se complementó nuevamente con timidina 2 mM durante 19 h antes de la recolección para la preparación del extracto.

Extractos de HeLa S3: Se lavaron células HeLa S3 síncronas en fase S con PBS 1x enfriado con hielo y se lisaron en un tampón de hinchamiento (HEPES 20 mM, pH 7,5, MgCl2 2 mM, KCl 5 mM, ditiotreitol [DTT] 1 mM y cóctel inhibidor de proteasa [Roche; n.º 11836170001]) complementado con una mezcla regeneradora de energía, E-mix (ATP 1 mM, etilenglicol-bis [β-aminoetil éter]-N,N,N′,N′-tetraacético 0,1 mM [EGTA], MgCl2 1 mM, fosfato de creatina 7,5 mM, creatina fosfoquinasa 50 μg/ml). Las células se incubaron en hielo durante 30 min y se homogeneizaron mediante ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y se pasaron 10 veces a través de una aguja de 21 G. Los extractos se aclararon mediante centrifugación posterior (17 000 × g; 10 y 40 min) y se almacenaron a –80 °C. Extractos mitóticos de NDB: las células de NDB inducidas por Tet se recolectaron de 20 a 24 platos de 150 mm mediante un lavado suave con PBS enfriado con hielo. Los extractos se prepararon como se describe anteriormente para las células HeLa S3. Para más detalles ver 17,32.

Las proteínas diana se expresaron in vitro utilizando lisado de reticulocitos de conejo (sistema de reticulocitos acoplado a TNT; Promega; #L4600, #L4610) complementado con una mezcla de 35S-metionina/SL-cisteína (PerkinElmer; #NEG772002MC) para la detección por radiografía o con metionina sin etiquetar (Promega #L118A) y FluoroTect™ GreenLys (Promega #L5001).

Los ensayos de degradación se realizaron en 20 μl de extracto celular complementado con 1 μl de mezcla regeneradora de energía 20x (ver arriba), 1 μl de solución de Ub de 10 mg/ml (Boston Biochem; #U-100H) y 1 μl de radiomarcado traducido in vitro. proteína de interés. Para un control negativo, la mezcla de reacción se complementó con inhibidor de proteasoma MG132 (20 μM; Boston Biochem; #I-130). Las mezclas de reacción se incubaron a 28 °C y se recogieron muestras de 4–5 µl en intervalos de 15–20 min. Detección fuera del chip: las muestras de puntos de tiempo se mezclaron con 4x Laemmli Sample Buffer (BIO-RAD #1610747), se desnaturalizaron (10 min, 95 °C) y se resolvieron mediante SDS-PAGE. Los geles se empaparon en una solución fijadora de metanol/ácido acético (10/7,5 %) durante 20 min, se secaron al vacío y con calor y se expusieron a una pantalla de fósforo (Fuji) durante 24–72 h. Las proteínas traducidas in vitro se visualizaron mediante autorradiografía usando Typhoon FLA 9500 Phosphorimager (GE Healthcare Life Sciences). La intensidad de la señal (corregida para la señal de fondo) se midió con el software ImageJ y se normalizó a la señal en t0. Todos los gráficos se crearon utilizando el software Microsoft Excel, versión 16.20. Los valores medios y SE se calcularon a partir de tres o cuatro ensayos de degradación independientes. Detección en chip: las muestras de puntos de tiempo se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Antes de la detección, las muestras se descongelaron en hielo, se hicieron fluir a través del chip durante 5 minutos y se inmovilizaron en cámaras de proteína debajo de la válvula de "botón" (ver "Química de la superficie" a continuación). A continuación, se cerraron las válvulas de 'botón', lo que permitió que el PBS lavara el material no unido. El nivel de proteínas diana (antes y después de las reacciones de degradación) se determinó mediante excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 535/25 nm. El nivel de proteína también podría medirse mediante inmunofluorescencia usando anticuerpos marcados con fluorescencia (anti-Flag-Alexa 647, μg/ml, #15009; Cell Signaling, Danvers, MA, EE. UU.). Estos anticuerpos se introdujeron en el dispositivo y se incubaron con las proteínas inmovilizadas bajo el "botón" durante 20 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos no unidos se lavaron mecánicamente con PBS después del cierre de la válvula de "botón". Aquí, los niveles de proteína objetivo se determinaron mediante excitación de 633 nm y un filtro de emisión de 692/40 nm.

El dispositivo de microfluidos está hecho de dos capas de PDMS. Las obleas de silicio se escriben mediante fotolitografía (Heidelberg MLA 150). Luego, se realiza la fase de litografía blanda utilizando elastómero de silicona polidimetilsiloxano (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, EE. UU.) y su agente de curado para fabricar los dispositivos microfluídicos. Los dispositivos microfluídicos constan de dos capas de PDMS alineadas, las capas de flujo y de control que se preparan utilizando diferentes proporciones de PDMS y su agente de curado; 5:1 y 20:1 para las capas de control y flujo, respectivamente. La capa de control se desgasifica y se hornea durante 30 min a 80 °C. La capa de flujo se recubre inicialmente por rotación (Laurell, EE. UU.) a 2000 rpm durante 60 s y se hornea a 80 °C durante 30 min. A continuación, las capas de flujo y control se alinean con una máquina alineadora automática (hecha a medida) bajo un estereoscopio y se hornean durante 1,5 h a 80 °C para la unión final. A continuación, el dispositivo de dos capas se despega de la oblea y se une a un cubreobjetos mediante tratamiento con plasma (aire, 30 %, 30 s). Mientras está en funcionamiento, el dispositivo está conectado a un colector neumático, utilizando tubos Tygon® y se opera automáticamente en función de un conjunto de comandos programados.

Se hace fluir BSA biotinilado (1 μg/μl, Thermo) durante 25 min a través del dispositivo, lo que permite su unión a la superficie epoxi. Encima de la BSA biotinilada, se añaden 0,5 μg/μl de NutraAvidin (Pierce, Rockford, IL) (flujo durante 20 min). Luego se cierra la válvula de "botón" y se hace fluir PEG biotinilado (1 μg/μl, (PG2-AMBN-5k, Nanocs Inc.) durante 20 min, pasivando la capa de flujo, excepto el área de los botones. Después de la pasivación , la válvula de 'botón' se libera y un flujo de 0,2 μg/μl de anticuerpos anti-GFP biotinilados (Abcam; #ab6658, Cambridge, Reino Unido) o 0,01 μg/μl de anticuerpos anti-Flag biotinilados (Cell Signaling; #2908 S Danvers , MA, EE. UU.). Los anticuerpos se unieron a la NutraAvidina expuesta, específicamente al área debajo del 'botón', creando una matriz de etiquetas anti-GFP o anti-Flag. Se usó tampón PBS para lavar entre los pasos. En el caso de la inmovilización de p27, la química de la superficie se realizó con 0,2 μg/ml de anticuerpos anti-IgG biotinilados completos anti-ratón de burro (n.º 715-065-150, laboratorios de investigación Jackson Immuno, Maryland, EE. UU.) seguidos de un flujo de 6,5 μg/ml de anticuerpos anti p27 (biotecnología de Santa Cruz, Heidelberg Alemania; ratón #1641).

Los productos Flag-Securin-GFP (wt y ∆64 mut) y p27-GFP IVT se introdujeron en el chip y se inmovilizaron en la superficie debajo del "botón" en las cámaras de proteína a través de su etiqueta GFP, seguido de lavado con tampón PBS y escaneado. A continuación, se abrieron las válvulas de "botón" y las mezclas de reacción del extracto se incubaron con las cámaras de proteína durante 60 min (30 °C). Durante la reacción, el nivel de la proteína diana restante se determinó mediante la señal de GFP cada 15 min. La disminución de la señal de GFP se correlacionó con la degradación. Después de restar la señal de fondo, las señales de GFP se normalizaron a la señal en t0 (valor de 1) o entre 1 (señal máxima) y 0 (señal mínima).

Para el análisis y la presentación de las imágenes se utilizaron el escáner de microarrays recargado LS, GenePix7.0 (Molecular Devices) y el software de análisis de imágenes ImageJ. La señal medida alrededor de la válvula de botón se consideró como fondo, ya que allí no se esperaba la inmovilización de proteínas. Sin embargo, siempre se detecta alguna señal de fondo, que resulta de la unión no específica de anticuerpos a la superficie del dispositivo. Restamos la señal de fondo alrededor de los botones en un anillo del tamaño de 2 R con un espaciado de 2 píxeles (ver material complementario en 27).

Las muestras de proteína se mezclaron con tampón Laemmli x4, se desnaturalizaron (10 min, 96 °C) y se resolvieron en gel de acrilamida al 10 % recién preparado usando un tampón de funcionamiento Tris-glicina. A continuación, las proteínas se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad; nº 162-0115) utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). Se utilizó la solución Ponceau S (Sigma-Aldrich; #81462) para verificar la calidad de la transferencia. La membrana se lavó (TBS), se bloqueó (leche desnatada al 5 % en TBST) y se incubó (RT, 1 h) con una solución de anticuerpos (BSA al 2,5 % y azida sódica al 0,05 % en PBS) antes de transferirla con anti-Securin (Abcam; # AB3305) anticuerpo primario (RT, 2 h). El anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-ratón se adquirió de Jackson ImmunoResearch (#115-035-003). La señal ECL se detectó usando EZ-ECL (Biological Industries; #20-500-171).

En general, los detalles sobre el diseño experimental y las estadísticas se dan en las secciones correspondientes. Los valores de p se calcularon en base a la prueba t no pareada de dos colas. En análisis de gel realizados por triplicado; las gráficas representan los valores de error medio y estándar (SE). Las estadísticas para el análisis en chip se derivaron de n = 10 a 57 unidades de celdas. Se muestran los valores medio y SE. El análisis estadístico y los gráficos se generaron utilizando el software Microsoft Excel v16.65.

Diseñamos pDOC para respaldar múltiples estrategias para analizar la degradación de proteínas in vitro, específicamente sistemas libres de células. El dispositivo se basa en un chip microfluídico integrado MITOMI, desarrollado originalmente para cuantificar las interacciones proteína-ligando en equilibrio24,33. El módulo MITOMI se modificó para contener una matriz de microcompartimentos de 16 × 64, 32 × 32 o 32 × 16. El último chip también fue diseñado para permitir la carga paralela (ver esquemas en la Fig. 1a). Cada compartimento, es decir, la unidad celular (Fig. 1b), está separado en dos cámaras y controlado por tres válvulas: una válvula de 'cuello' que controla la difusión (mezcla) del material desde la cámara I hacia la 'cámara de proteínas', en la que se atrapa una proteína diana específica; una válvula 'sándwich' que separa las unidades de celdas; y la válvula de "botón" MITOMI, que atrapa las moléculas que interactúan debajo de ella, tomando así una instantánea de la interacción en equilibrio (Fig. 1b). La cámara I se puede cargar de una de dos maneras: 1) Carga "similar a un gel", que permite la carga secuencial o paralela de 32 muestras. Esto se realiza mediante una serie de canales de entrada individuales controlados por microválvulas. La ventaja de este enfoque es el menor tiempo de obtención de resultados, su relativa simplicidad y la similitud conceptual con los protocolos convencionales basados ​​en gel. 2) Carga de micromatrices, es decir, se transcriben en el chip granjas de lectura abierta (ORF) premarcadas para generar una matriz de proteínas recién expresadas. Este enfoque aumenta el rendimiento. No menos importante, reduce el consumo de reactivos en al menos 3 órdenes de magnitud en comparación con el ensayo convencional. Cada reacción tiene menos de un nanolitro en volumen. El colector común se usa luego para cargar materiales comunes en las diferentes secciones del dispositivo (p. ej., para la química de superficies). Además, los diseños de chips pDOC incluyen la separación del control maestro de las tres válvulas en secciones del chip que se pueden activar y controlar de forma independiente. En comparación con el control de cada tipo de válvula para todo el chip, esta separación no solo mejora la respuesta de la válvula, sino que, lo que es más importante, permite realizar ensayos de respuesta temporal en el chip. Dentro de cada sección, los experimentos se pueden realizar en todas las unidades de celda en paralelo, lo que permite aplicaciones multiplexadas del tipo que se muestra en nuestros dispositivos anteriores24,25,26,34.

a pDOC es una plataforma de microfluidos basada en MITOMI. El dispositivo incluye capas de flujo (verde) y control (magenta), y varios módulos: 1) colector común que permite la carga de materiales, que en combinación con microarray puede permitir hasta 512 experimentos diferentes; 2) Entradas de carga paralelas que permiten la carga similar a un gel de hasta 32 condiciones experimentales diferentes; y 3) módulo MITOMI de 512 unidades celulares, que controla el proceso de ensayo de degradación. b Una ilustración de dos unidades celulares. Cada unidad de celda (marcada con un marco de puntos negros) consta de dos cámaras controladas por tres válvulas neumáticas integradas. El volumen total de cada unidad es de aproximadamente 1 nanolitro. Las dos cámaras están separadas por la 'válvula de cuello' (I). Las diferentes unidades de celdas se separan a través de válvulas sándwich (II). Las muestras que contienen proteínas objetivo (productos IVT) se cargan en la cámara de proteínas y se inmovilizan a través de anticuerpos biotinilados que pueden ser específicos de proteínas o etiquetas. Las proteínas diana quedan atrapadas a través de la válvula de botón MITOMI (III) para su cuantificación, mientras que los biomateriales restantes no unidos se eliminan por lavado. La dirección del flujo dentro del dispositivo se indica mediante flechas verdes. c Izquierda, una imagen de unidades de celda dentro de la matriz MITOMI. Las proteínas diana pueden inmovilizarse en la cámara de proteínas y cuantificarse de varias maneras (ilustradas a la derecha): i) Un ejemplo de una proteína diana que lleva una etiqueta fluorescente (p. ej., GFP) para detección (ver etiqueta verde brillante) y una proteína no etiqueta fluorescente para inmovilización; ii) Una proteína diana marcada con GFP tanto para inmovilización (por anticuerpos anti-GFP) como para detección; iii) La proteína diana no está marcada. La detección se basa en la lisina fluorescente (Lys) incorporada durante la traducción in vitro. La inmovilización se realiza a través de anticuerpos específicos de proteínas. iv) La proteína diana se inmoviliza a través de anticuerpos específicos de etiqueta o proteína y se detecta mediante inmunofluorescencia a través de anticuerpos específicos de etiqueta acoplados a fluoróforo. En general, la inmovilización en chip de proteínas diana se basa en anticuerpos biotinilados. La inmovilización a través de anticuerpos no biotinilados es posible si la química de la superficie incluye IgG biotinilada.

Al igual que los ensayos de degradación clásicos, las proteínas diana para los análisis de pDOC se traducen in vitro (IVT) utilizando lisado de reticulocitos de conejo que permite el plegamiento correcto y las modificaciones postraduccionales (PTM). Los productos IVT se inmovilizan en la superficie de vidrio del chip a través de la unión biotina-avidina. Para ello, se aplican anticuerpos biotinilados específicos debajo de la válvula de botón. Después de la extracción de la proteína diana, el material no unido, como el lisado de reticulocitos y el extracto celular, se elimina por lavado. Luego, todo el chip se pasiva con PEG-Biotin, excepto el área debajo del botón (Fig. 1b). Las proteínas diana unidas se cuantifican fluorométricamente. Para más detalles, consulte nuestras publicaciones anteriores25,26,34.

El dispositivo es compatible con múltiples estrategias de química de superficie y posibles configuraciones experimentales (ilustradas en la Fig. 1c): 1) La proteína objetivo está etiquetada en los extremos N' y C'. Una etiqueta se utiliza para la inmovilización a través de anticuerpos biotinilados específicos de la etiqueta y la segunda etiqueta es una proteína fluorescente (p. ej., GFP), que se utiliza para la detección. 2) Se utiliza una proteína fluorescente tanto para la inmovilización como para la detección. 3) La proteína diana se traduce en un lisado que contiene lisina fluorescente (Lys verde) y se inmoviliza mediante anticuerpos específicos de proteína. 4) La proteína diana está doblemente etiquetada. Aquí, sin embargo, se usa una etiqueta para la inmovilización mientras que la segunda etiqueta es inmunodetectable por el anticuerpo fluorescente. Es importante destacar que la inmovilización se puede realizar con anticuerpos no biotinilados si la química de la superficie también incluye anti IgG biotinilado. Esta flexibilidad de inmovilización y cuantificación de proteínas simplifica la optimización del ensayo según las necesidades y limitaciones específicas, y la versatilidad general de la plataforma.

Conceptualmente, el análisis de la degradación de proteínas por pDOC es directo, simple y rápido; la detección de señales se basa en la cuantificación in situ, lo que evita la electroforesis en gel y cualquier otro procedimiento relacionado con el gel, por ejemplo: fijación, secado, autorradiografía o inmunotransferencia y exposición. Nuestro primer objetivo fue examinar si la sensibilidad de la señal y el rango dinámico de pDOC permiten la cuantificación basada en el tiempo de productos IVT cuya degradación en extractos libres de células se analizó en tubo, es decir, fuera del chip. Como prueba de concepto, utilizamos extractos mitóticos de células HEK293 que están bloqueadas en un estado similar a la anafase debido a los altos niveles de ciclina-B1 no degradable. Este sistema libre de células mitóticas, en lo sucesivo denominado NDB, recapitula la proteólisis mediada por APC/CCdc20 de las proteínas del ciclo celular Securin y Geminin17,35. Los ensayos de degradación convencionales de Flag-Securin-GFP y Flag-Geminin-GFP radiomarcados (productos IVT) en extractos mitóticos de NDB se muestran en la Fig. 2a (ver también Fig. S1). Los experimentos de control con variantes mutantes no degradables (Geminin ∆27 y Securin ∆64) demuestran la especificidad del ensayo. Los productos IVT no radiactivos equivalentes se ensayaron de manera similar. Primero, realizamos un ensayo de punto final (Fig. 2b). Después de una incubación de 60 minutos con extractos mitóticos de NDB, las muestras de reacción se cargaron en pDOC a través de canales separados y se escanearon en busca de fluorescencia GFP. Las reacciones de control, en las que los productos IVT se incubaron en PBS, nos permitieron normalizar el nivel de cada proteína diana en t60 min (proporción extractos/PBS) y estimar las señales de fondo. En general, la detección en el chip demuestra una fuerte reducción en el nivel de Geminin y Securin después de la incubación en extractos mitóticos de NDB, mientras que las variantes no degradables permanecieron estables, exhibiendo ~80 % de las señales de GFP de control en PBS. En este momento, notamos que las señales de fondo del lisado de reticulocitos, los extractos celulares y la inmovilización no específica eran menores (Fig. S2).

a Degradación dependiente del tiempo de Flag-Securin-GFP, Flag-Geminin-GFP marcados con 35S y sus variantes no degradables (∆64 y ∆27, respectivamente) en extractos mitóticos de NDB (20 µl) suplementados con E-mix y ubiquitina . La proteólisis dependiente del tiempo se resolvió mediante SDS-PAGE y autorradiografía. b Se realizaron ensayos equivalentes con productos IVT no radiactivos. Las proteínas diana se incubaron durante 1 hora en una solución de reacción que contenía extractos o PBS (control). A continuación, se cargaron alícuotas de cada mezcla de reacción (5 µl) directamente en un chip a través de canales separados, cada uno de los cuales contenía docenas de unidades celulares. Las proteínas diana se inmovilizaron en cámaras de proteínas a través de anticuerpos anti-GFP biotinilados. La etiqueta GFP también se utilizó para la cuantificación. Las señales de GFP se calcularon a partir de 14 a 19 unidades celulares por proteína objetivo por condición de reacción (extractos frente a PBS). Los diagramas de caja representan proporciones de señales GFP (extractos/PBS) en t60 min. Se indican la media (x) y la mediana (-). *valor p < 0,001. Se muestran datos sin procesar representativos que representan la detección en el chip de las cuatro proteínas objetivo. c La degradación de la variante Flag-Securin-GFP se analizó en un tubo como se describe en B. Aquí, sin embargo, las alícuotas se congelaron instantáneamente cada 15 min. Luego, las muestras de lapso de tiempo se cargaron en el chip para su análisis. Las proteínas objetivo se inmovilizaron en cámaras de proteínas a través de anticuerpos anti-GFP y se cuantificaron en función de la fluorescencia de GFP. Las degradaciones dependientes del tiempo de wt vs. Securin mutante se cuantificaron en función de la señal 35S (análisis estándar; n = 3] y la fluorescencia de GFP (análisis en chip). Los gráficos representan las señales medias y las barras de error estándar. Las señales medias se calcularon a partir de 26 celdas. unidades y normalizado entre los valores máximo (1, t0) y mínimo (0, t60 min), lo que permite una comparación adecuada entre dos métodos de detección muy diferentes. Se muestran las barras de error. d Experimento equivalente a (c) realizado con Flag-Geminin-GFP , excepto que la inmovilización se basó en anticuerpos anti-Flag, n = 30-40 unidades celulares.

A continuación, probamos si pDOC se puede utilizar para obtener información cinética confiable sobre la degradación de proteínas. Flag-Securin-GFP y Flag-Geminin-GFP se incubaron en extractos mitóticos de NDB durante 60 minutos, y las muestras de reacción se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido cada 15 minutos. Después de una descongelación rápida, se cargaron en el chip muestras que representaban cinco puntos de tiempo para la cuantificación de la señal. Se realizaron análisis comparables utilizando SDS-PAGE y autorradiografía. Las variantes Flag-Securin∆64-GFP y Flag-Geminin∆27-GFP no degradables también se analizaron mediante autorradiografía para el control. Teniendo en cuenta las grandes diferencias entre los dos métodos de detección, las señales de autorradiografía y GFP se normalizaron entre 0 y 1, lo que significa que la señal en t60 min se restó de todos los demás puntos de tiempo. Los valores resultantes se normalizaron a la señal máxima en t0 y se representaron gráficamente. Como se muestra en la Fig. 2c, d, el análisis en chip por pDOC y el análisis fuera de chip por autorradiografía SDS-PAGE exhibieron patrones de degradación casi idénticos de Flag-Securin-GFP y Flag-Geminin-GFP. Tenga en cuenta que los cócteles de reacción contenían 1 μl de IVT, 20 μl de extractos y 2 μl de ubiquitina/E. solución mixta, siguiendo nuestro protocolo estándar17,27,36. Para cada punto de tiempo, se hicieron fluir 5 μl de mezclas de reacción durante un período de 5 min a través de cámaras de proteína con válvulas de botón MITOMI abiertas, lo que permitió la inmovilización de la proteína objetivo, mientras que las válvulas de cuello estaban cerradas. Este protocolo de carga permitió una visualización clara de la proteína objetivo sin preocuparse por la saturación de la señal (Fig. S3). Llegamos a la conclusión de que pDOC facilita los análisis de punto final y de evolución temporal de la degradación de proteínas in vitro. Es importante destacar que Flag-Securin-GFP se inmovilizó en cámaras de proteínas a través de anticuerpos anti-GFP biotinilados en lugar de anticuerpos anti-Flag. Al hacerlo, demostramos efectivamente que GFP puede servir tanto para la inmovilización como para la detección, eliminando la necesidad de dos etiquetas. En general, consideramos que GFP es una etiqueta óptima para la detección de señales en el chip.

Sin embargo, la fusión de una proteína fluorescente con una proteína diana puede distorsionar el plegamiento de la proteína de manera que limite efectivamente la proteólisis. Por lo tanto, la cuantificación de proteínas independiente de las etiquetas de proteínas fluorescentes puede, en algunos casos, ser importante. En este contexto, la flexibilidad de pDOC es particularmente ventajosa. La Figura 3a muestra dos configuraciones alternativas mediante las cuales la degradación de Securin podría registrarse en el chip: 1) detección directa por green-Lys; y 2) detección indirecta por inmunofluorescencia in situ. El nivel de Securin se midió en t0 y t60 min. Ambos enfoques fueron informativos, revelando la degradación de Securin en el entorno mitótico de NDB, de manera inequívoca. Con respecto a la detección directa, cabe destacar que los productos IVT etiquetados con GFP son, en general, más brillantes que las proteínas equivalentes etiquetadas con green-Lys. Sin embargo, de facto, este experimento demuestra que la Lys verde integrada no bloquea la proteolisis que se basa en la modificación química de los residuos de Lys37. La detección indirecta por inmunofluorescencia se basa inherentemente en dos etiquetas (no se puede usar una sola etiqueta tanto para el inmunomarcaje como para la inmovilización) y requiere una incubación adicional de 30 min. Sin embargo, el tamaño pequeño de las etiquetas inmunodetectables estándar minimiza el riesgo de plegamiento incorrecto de la proteína y la señal brillante emitida por los fluoróforos comerciales a los que se acoplan los anticuerpos es ventajosa.

a La degradación de Flag-Securin-Myc, Flag-Securin-GFP y Flag-Securin marcada con Green-Lys (productos IVT) en extractos mitóticos NDB se analizó en un tubo durante 1 hora. El análisis en el chip se realizó de varias maneras: 1) Flag-Securin-Myc se inmovilizó mediante anticuerpos anti-Myc y se detectó mediante anticuerpos anti-Flag Cy5 conjugados; 2) Flag-Securin-GFP fue inmovilizado y detectado a través de la etiqueta GFP; y 3) Flag-Securin marcado con Green-Lys se inmovilizó a través de anticuerpos anti-Flag y se detectó mediante la señal de Green-Lys. Los anticuerpos anti-Myc/Flag/GFP están biotinilados. Las gráficas y los datos sin procesar representan los niveles de proteína en t0 frente a t60 min. Las señales se normalizan a valores máximos en t0. Se muestran los valores medios y las barras de error estándar; n = 20–40 unidades celulares. *valor p < 0,001. b La degradación de p27 marcada con Green-Lys (sin etiquetar) y Flag-Securin-GFP se ensayó en extractos de fase S y se analizó mediante pDOC. p27 se inmovilizó a través de anticuerpos anti-IgG de ratón y anti-p27 biotinilados. Se usó la señal de Green-Lys para la detección. Flag-Securin-GFP se inmovilizó a través de anticuerpos anti-Flag biotinilados. Después de la incubación con extractos celulares, los niveles de proteína se cuantificaron mediante fluorescencia GFP o Green-Lys en intervalos de 15 min. Los gráficos representan los valores de error estándar y medio normalizados a la señal máxima en t0. n = 20 (p27) y 10 (Securin) unidades celulares.

La versatilidad de pDOC se demostró aún más utilizando p27 sin etiquetas (Fig. 3b). La degradación de p27 está mediada por la ligasa SCFSkp2 E3, en lugar de APC/C, y está coordinada con la fase de síntesis de ADN (S) del ciclo celular38. La degradación de p27 se ensayó en extractos de células HeLa S3 sincrónicas en fase S y se analizó mediante pDOC. La proteína se inmovilizó a través de anticuerpos anti-p27 y anti-IgG biotinilados, y se detectó mediante green-Lys. El análisis por pDOC reveló la inestabilidad estereotipada de p27 en extractos de fase S (Fig. 3b). El patrón de degradación se parecía al medido por autorradiografía (Fig. S4). Por lo tanto, pDOC se puede utilizar para ensayos de degradación de proteínas no etiquetadas. Además, el método es específico y no está restringido a un determinado tipo de sistemas sin células.

Las ventajas de los ensayos de degradación basados ​​en autorradiografía incluyen una alta relación señal/ruido, alta especificidad de la señal y linealidad del ensayo. Sin embargo, esto no viene sin un costo. Primero, el isótopo 35S es un reactivo de vida corta con una vida media de ~3 meses. En segundo lugar, en el gel, la señal se distribuye en un pocillo de 4 a 5 mm de ancho (gel estándar de 10 pocillos). En tercer lugar, en un ensayo de degradación estándar, se diluyen 1–2 μl del producto IVT en 20–30 μl de extractos celulares cuya concentración de proteínas es de aproximadamente 20–25 mg/ml. Por lo tanto, la cantidad de IVT cargada por carril está limitada por la capacidad máxima de separación del gel. Por lo general, cargamos de 4 a 5 μl de mezcla de reacción en un pocillo de un minigel estándar de 10 pocillos de 1 mm de espesor. En cuarto lugar, la traducción in vitro es un desafío para las proteínas grandes debido a la procesividad de los ribosomas. Por lo tanto, aunque las proteínas grandes incorporan más metionina/cisteína radiomarcada en relación con las proteínas pequeñas, la señal general de la proteína de longitud completa puede resultar poco práctica para una cuantificación fiable. En quinto lugar, el tiempo de exposición necesario para una señal de alta calidad suele oscilar entre 12 y 24 h. Tenga en cuenta que los puntos 2 a 4 mencionados anteriormente son igualmente relevantes cuando la degradación de proteínas se analiza mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. En cuanto al punto 5, la inmunotransferencia no requiere largas exposiciones. Sin embargo, el tiempo total de incubación con anticuerpos es largo. Además, los productos IVT en los ensayos basados ​​en inmunotransferencia deben etiquetarse para distinguirlos de las proteínas endógenas en los extractos. En este punto, es importante tener en cuenta que, ya sea que la degradación se analice mediante autorradiografía o inmunotransferencia, la expresión informativa de los productos IVT debe validarse de antemano, en sí misma, un procedimiento de un día de duración. La validación equivalente por pDOC es instantánea.

En el chip, las señales de fluorescencia de Flag-Securin-GFP en t60 min estaban por encima del nivel de fondo y eran más notorias en comparación con la autorradiografía (Figs. 2a y 3a). Sin embargo, cuando la señal en t60 min se restó de todos los demás puntos de tiempo, los patrones de degradación general de Flag-Securin-GFP, según lo revelado por pDOC y autorradiografía, fueron similares (Fig. 2c, d). Esta observación sugiere que el pDOC detecta residuos de proteínas que aún persisten en la mezcla de reacción después de 60 minutos de incubación, y que apenas se detectan mediante autorradiografía, si es que se detectan. Por lo tanto, se puede argumentar que la sensibilidad de pDOC supera la de la autorradiografía convencional y, de ser así, pDOC no solo facilita los ensayos de degradación in vitro, sino que también reduce significativamente el consumo de reactivos y el costo por ensayo. Para probar eso, diluimos Flag-Securin-GFP en lisado de reticulocitos 4 y 10 veces e incubamos el sustrato en extractos mitóticos de NDB durante 1 h, manteniendo la proporción original de lisado de reticulocitos/volumen de extracto de 1/20 (µl). Las muestras de puntos de tiempo se analizaron mediante pDOC (basado en la fluorescencia de GFP). Experimentos equivalentes realizados en paralelo con Flag-Securin-GFP marcado con 35S, siguiendo el ensayo convencional (Figs. 4 y S5). Para aclarar, los sustratos radiomarcados y no radiomarcados se expresaron simultáneamente a partir de la misma mezcla de solución de TNT®/ADN. Además, los ensayos de degradación se realizaron un día después de la entrega de la solución de 35S-Met/35S-Cys a nuestro laboratorio (~1175 Ci/mmol), y los geles se expusieron a una pantalla de fósforo durante la noche. Sin embargo, cada vez que se diluyó el sustrato IVT, la señal obtenida por autorradiografía estuvo por debajo de cualquier estándar aceptable, incluso en t0, y disminuyó a niveles apenas o indetectables después de 15 minutos de incubación (Figs. 4a y S5). Por el contrario, los análisis por pDOC fueron informativos en las tres condiciones (Fig. 4b). Pudimos detectar señales de buena fe de Flag-Securin-GFP diluido 4 y 10 veces en t0 así como en t60 min, registrando la dinámica completa de la proteína en extractos mitóticos NDB. En una nota más práctica, demostramos efectivamente que la degradación de proteínas se puede analizar con 0,1 µl de producto IVT y 2 µl de extractos celulares, ahorrando así el 90 % de los reactivos. Esta característica es particularmente valiosa en ensayos que se basan en material biológico limitado, por ejemplo, extractos de células primarias y muestras de tejido normal/patológico.

un ensayo de degradación dependiente del tiempo de Flag-Securin-GFP marcado con 35S en extractos mitóticos de NDB. Los ensayos se realizaron con producto IVT sin diluir (100 %) o después de una dilución 4x/10x en lisado de reticulocitos (25 y 10 %, respectivamente). En todos los ensayos, se incubó 1 µl de sustrato en 20 µl de extractos celulares. Las muestras se congelaron instantáneamente en intervalos de 20 minutos y se analizaron mediante SDS-PAGE y autorradiografía. b Ensayos de degradación equivalentes realizados con Flag-Securin-GFP no radiactivo. Las muestras de puntos de tiempo se cargaron en el chip para inmovilización (a través de anticuerpos anti-GFP-biotinilados) y detección (fluorescencia de GFP). Las gráficas resumen los datos de tres experimentos, 15 a 20 unidades de celda por experimento. Se muestran los valores de error estándar y promedio normalizados (izquierda). Los datos brutos representativos se muestran a la derecha.

pDOC revela la cantidad remanente de Flag-Securin-GFP que no se pudo visualizar con métodos convencionales. Curiosamente, si bien el patrón de degradación general de Flag-Securin-GFP en las tres condiciones fue similar, notamos un retraso sistemático en la degradación de Flag-Securin-GFP a medida que se redujo la concentración de sustrato. Esta observación no se ha identificado previamente en nuestro laboratorio y podría atribuirse a pasos limitantes de la velocidad a lo largo del proceso de ubiquitinación/degradación de Securin, y quizás sustratos de APC/C en general39,40. Tenga en cuenta que la concentración estimada de Flag-Securin-GFP en la mezcla de reacción fue de 17 nM (antes de una mayor dilución en lisado de reticulocitos; Fig. S6).

Hasta ahora, hemos demostrado la capacidad de pDOC para facilitar el análisis de las reacciones de degradación de proteínas, que se realizaron en el tubo, es decir, fuera del chip (Figs. 2-4). Técnicamente, sin embargo, las válvulas de cuello y de botón MITOMI permiten una mezcla regulada en el tiempo entre la proteína objetivo y los extractos libres de células dentro de cada unidad celular. Más específicamente, la carga y la inmovilización de las proteínas diana se realizan con válvulas de cuello cerrado. Una vez que las proteínas objetivo quedan atrapadas bajo los botones MITOMI cerrados, los extractos de células pueden volar al chip. Este paso se realiza con válvulas de cuello abierto, lo que permite que los extractos de células lleguen a la cámara I. Los extractos de células pueden quedar atrapados en la cámara I, denominada aquí "cámara de extracción", cerrando de nuevo la válvula de cuello, y todos los materiales restantes se eliminan por lavado. La reacción de degradación comienza (t0) con la apertura de las válvulas de botón MITOMI y de cuello. Los extractos celulares se difunden en la cámara de proteínas y alcanzan la proteína diana expuesta (ilustrada en la Fig. 5a). Potencialmente, esta tubería permite un ensayo completo en chip para la degradación de proteínas. La motivación para un ensayo en chip es triple: 1) ahorro de reactivos y costo por ensayo. De hecho, 5 μl de extractos celulares son suficientes para llenar mil unidades celulares; 2) análisis de la degradación de proteínas en tiempo real. 3) mayor rendimiento, especialmente si las proteínas diana se expresan en el chip, como se demostró anteriormente25,26,27. El desafío, sin embargo, es la capacidad de degradación limitada de <1 nl de extractos por unidad celular, que nunca se ha probado en ninguna plataforma. Decidimos probar la viabilidad de la degradación de proteínas en un chip. Con este fin, se cargaron en el chip variantes wt y no degradables de Flag-Securin-GFP, así como Flag-p27-GFP (productos IVT) (a través de canales separados) y se capturaron en cámaras de proteínas debajo de la válvula de botón MITOMI a través de biotinilados. anticuerpo anti-GFP. Después del lavado, los extractos mitóticos de NDB se cargaron en la cámara de extracción y se atraparon cerrando la válvula del cuello. Los materiales no atrapados fueron lavados. El dispositivo se calentó a 30 °C y se escaneó para obtener señales de t0. La apertura del cuello y la válvula de botón MITOMI iniciaron reacciones de degradación en todas las unidades celulares simultáneamente (Fig. 5a, b), y el chip se escaneó en intervalos de tiempo de 15 min. Mientras que la señal fluorescente de Securin no degradable, p27, así como la propia GFP (Fig. S7), permaneció estable en los extractos mitóticos de NDB durante todo el experimento, la señal de Flag-Securin-GFP disminuyó con el tiempo (Fig. 5c), revelando la proteólisis regulada de esta proteína en ambiente mitótico.

a, b Ilustración esquemática del ensayo completo de degradación en chip por pDOC. Los productos de proteína IVT se inmovilizan en la superficie de la "cámara de proteína" a través del anticuerpo biotinilado anti GFP (ver más información en la Fig. 1). El cierre de la válvula de botón MITOMI atrapa la proteína. Todos los restos se lavan con PBS. La correcta expresión e inmovilización de las proteínas diana se validan mediante exploración. A continuación, los extractos libres de células se cargan en la cámara de extracción y se atrapan cerrando la válvula del cuello. La reacción comienza con la apertura del cuello y las válvulas de botón MITOMI, lo que permite la difusión de extractos celulares en la "cámara de proteínas" y la mezcla con la proteína objetivo. El chip se coloca en una placa caliente a 30 °C y se escanea a intervalos de 15 min para proporcionar información cinética en tiempo real. c Los productos Securin y p27 IVT marcados con GFP se inmovilizaron a través del anticuerpo biotinilado anti-GFP. A continuación, las cámaras de extracción se llenaron con extractos mitóticos de NDB que respaldan la ubiquitinación de Securin, pero no de su variante no degradable (Δ64) y p27 (control negativo que valida la especificidad del ensayo). La degradación de proteínas se ensayó durante 1 hora, durante la cual se escaneó el chip cinco veces. El gráfico representa señales GFP medias normalizadas a t0 y barras de error estándar; n = 14–30 unidades celulares. Los datos brutos representativos de p27 y Securin se muestran a la derecha.

La lisina es el sitio principal para la ubiquitinación y docenas de otros PTM que pueden regular la degradación de proteínas de manera menos directa. Aprovechamos la capacidad de multiplexación de pDOC y probamos la contribución de los residuos de lisina a la degradación general de Geminin en un entorno mitótico. Los elementos cis que regulan la degradación de Geminin se encuentran en el extremo N de la proteína. De hecho, la proteína fluorescente monomérica Azami-Green (mAG) unida a los primeros 110 aminoácidos de Geminin (mAG-Geminin) es un marcador bien conocido de la actividad APC/C en las células31,41. Construimos un mAG-Geminin marcado con Flag, en lo sucesivo denominado 'Geminin-degron', y generamos un panel de variantes mutantes en las que los residuos de lisina (K) individuales se sustituyeron con alanina (A). También se construyó una variante no degradable, en la que la secuencia de la caja de destrucción 23RxxL26,42 se sustituyó por GxxV (código de un solo aminoácido) (Fig. 6a). La degradación de todas las variantes en los extractos mitóticos de NDB se analizó primero en el chip (consulte la Fig. 5 para obtener más detalles técnicos). Los productos IVT se inmovilizaron en el chip a través de anticuerpos anti-Flag biotinilados y se cuantificaron mediante fluorescencia mAG en t0 y t60 min. La relación de señal entre estos puntos de tiempo se normalizó entre 0 y 1, es decir, la relación calculada para los grados de geminina wt (0) y no degradable (1) (Fig. 6b). A continuación, un subconjunto de variantes mutantes se sometió a reacciones de degradación fuera del chip seguidas de un análisis en el chip (Fig. 6c; consulte la Fig. 2 para obtener más detalles técnicos). Se observó una tendencia de degradación similar en ambos ensayos de punto final (Fig. 6d). Tenga en cuenta que la misma estrategia utilizada para la cuantificación y normalización de la señal. Es importante destacar que los dos ensayos exhibieron una capacidad de degradación limitada para la variante K50A en extractos mitóticos de NDB. La estabilidad parcial de la variante K50A se validó aún más mediante un análisis de degradación dependiente del tiempo (Fig. 6e). Con este fin, se tomaron muestras de las reacciones de degradación en el tubo cada 20 minutos y se analizaron en el chip. Curiosamente, la variante de degradación limitada o K50A no pudo detectarse mediante SDS-PAGE y autorradiografía (Figs. 6f y S8). Esta discrepancia puede explicarse por la sensibilidad diferencial de los dos métodos y la capacidad de pDOC para detectar cantidades menores de sustrato (Fig. 4). En conjunto, nuestros hallazgos sugieren que la lisina 50 contribuye a la degradación de Geminin. En este momento, no está claro si la lisina 50 está poliubiquitinada. Pero si tuviéramos que seguir este modelo, la ubiquitinación de Geminin claramente no está restringida a la lisina 50 o, de lo contrario, la variante K50A se habría mantenido estable en los extractos mitóticos de NDB. Más generalmente, los datos presentados en la Fig. 6 demuestran un análisis sistemático de la degradación de proteínas por pDOC.

a Una ilustración de Geminin-degron etiquetado con Flag y mAG. Las lisinas y el elemento central (RxxL) de la caja de destrucción (caja D) se indican mediante un código de aminoácidos de una sola letra. Las variantes mutantes se generaron sustituyendo residuos de lisina individuales con alanina. La geminina mutante D-box (DBM) transporta glicina y valina en las posiciones 23 y 26, respectivamente. b Análisis de degradación de punto final de variantes de grado Geminin en chip. La línea discontinua representa un valor de corte (es decir, cuatro desviaciones estándar de wt Geminin-degron en t0) por encima del cual se marcaron las variantes para análisis adicionales. c Análisis de degradaciones de punto final de variantes de grado Geminina seleccionadas. Las reacciones de degradación se realizaron en el tubo y los niveles de proteína se cuantificaron en el chip (consulte la Fig. 2 para obtener detalles técnicos). b, c Se trazan los niveles normalizados de variantes de grado Geminin en t60 min. n = 12–38 (b) y 21–57 (c) unidades celulares. d Una correlación lineal entre los datos representados en B y C. Se muestran los valores de error medio y estándar. e, f Las degradaciones dependientes del tiempo de las variantes de Geminin-degron (en el tubo) se analizaron en el chip (e; n = 16–25 unidades celulares) mediante SDS-PAGE y autorradiografía (f; Los datos sin procesar representativos se muestran a la izquierda; n = 3). Todas las reacciones de degradación están en extractos mitóticos de NDB.

pDOC es una plataforma de laboratorio en chip diseñada para facilitar y simplificar el descubrimiento y el análisis de la degradación de proteínas en contextos fisiológicamente relevantes. El chip tiene capacidad para cientos de microcámaras en las que se puede analizar la degradación de proteínas de manera rápida y simultánea. Sin embargo, es importante enfatizar que la motivación y la necesidad de pDOC trasciende con creces su potencial de alto rendimiento: 1) los análisis se pueden realizar con cantidades de reactivos considerablemente menores en comparación con los ensayos convencionales. La última característica es especialmente crucial para los extractos libres de células cuya producción puede ser un cuello de botella en términos de tiempo, actividad y cantidad, por ejemplo, extractos de células cuyo origen son preciosas muestras de tejido normal/maligno con fines de investigación biomédica global/personal. diagnóstico; 2) La detección de señales se basa en la cuantificación in situ de la señal fluorescente. El método es independiente de materiales radiactivos contaminantes y, sin embargo, tiene una sensibilidad que supera los ensayos tradicionales. En la Fig. 7 se ilustra una comparación entre pDOC y el ensayo de degradación convencional. La flexibilidad de pDOC es sustancial; la plataforma facilita casi todos los diseños experimentales posibles. En primer lugar, se pueden analizar proteínas etiquetadas y no etiquetadas, y la detección se basa en la incorporación de Green-Lys, proteínas fluorescentes o etiquetas inmunodetectables. En segundo lugar, pDOC se puede utilizar como una columna de microfluidos integrada para análisis instantáneos de reacciones de degradación fuera del chip de bajo volumen (Figs. 2–3). La integración de dos módulos de carga permite la carga simultánea de docenas de soluciones de reacción en el chip. Las proteínas diana se purifican y concentran en la cámara de proteínas de las unidades celulares, lo que permite la detección en el chip de la degradación fuera del chip en cuestión de minutos a 1 h (según el protocolo de detección). Alternativamente, la degradación de proteínas se puede analizar completamente en el chip y en tiempo real. Esta característica de pDOC es importante no solo por la capacidad de probar la degradación de proteínas en un volumen de subnanolitros, sino también por la compatibilidad inherente de los dispositivos basados ​​en MITOMI con la traducción in vitro en chip24,25,27. Al expresar una matriz de proteínas en el chip, se pueden multiplexar proteínas objetivo de decenas a cientos, lo que aumenta drásticamente el rendimiento. La desventaja de la expresión en chip es que el ensamblaje del dispositivo con el microarray de ADN no es trivial y actualmente debe ser realizado por expertos en laboratorios especializados. En general, la naturaleza múltiplex de pDOC es bilateral: se puede aplicar una solución de reacción a docenas o cientos de proteínas diferentes, o se puede analizar una o varias proteínas para determinar su degradación en múltiples condiciones fisicoquímicas, simultáneamente. Esta cualidad es relevante para el análisis de reacciones de degradación dentro y fuera del chip.

El propósito de todos los métodos es analizar la degradación de proteínas de los productos proteicos IVT en una mezcla de reacción que comprende extractos libres de células, ubiquitina recombinante y una mezcla de regeneración de energía (E. mix). El ensayo estándar (tubería roja) suele ser radiactivo. Un producto IVT marcado con 35S (1–2 µl) se mezcla con 20–50 µl de la mezcla de reacción y se incuba durante 30–90 min. En cada punto de tiempo se recolecta una alícuota (~5 µl) de la mezcla de reacción. Las muestras se desnaturalizan y resuelven mediante SDS-PAGE. Después del secado, el gel se expone a una pantalla de fósforo. Por lo general, se obtiene una señal satisfactoria durante la noche (ON). A menudo se necesitan exposiciones más largas (24 a 72 h) cuando la señal radiactiva es baja debido a una variedad de razones. pDOC proporciona dos ensayos alternativos (tuberías azules), ambos con beneficios. Estrategia I: Las reacciones de degradación se realizan fuera del chip. La proteína objetivo se fusiona con una etiqueta estándar (p. ej., GFP, Flag, Myc, etc.) o se traduce en presencia de Green-Lys. Las muestras de puntos de tiempo se cargan en el chip secuencialmente o se hierven/congelan primero y luego se cargan simultáneamente. La proteína diana se inmoviliza mediante anticuerpos de superficie específicos de etiqueta/proteína, todos los demás materiales se eliminan por lavado y la cuantificación se lleva a cabo mediante una de las estrategias detalladas en la Fig. 1c casi al instante. Estrategia II: aquí, las proteínas objetivo y los extractos celulares se cargan en el chip sucesivamente y ocupan cámaras separadas dentro de cada unidad celular. La mezcla de los dos marciales inicia la reacción. El escaneo de lapso de tiempo proporciona información cinética. Mientras que la estrategia I es más simple, la estrategia II es más óptima para experimentos de alto rendimiento. Ambas estrategias en chip ahorran reactivos y son considerablemente más cortas que el ensayo estándar.

La proteólisis mediada por ubiquitina se analiza de forma rutinaria en cientos de laboratorios de todo el mundo. Además, es una importante vía de señalización para la terapia (p. ej., Velcade®) y el diseño de fármacos (p. ej., Nurix Therapeutics). Ideamos pDOC para facilitar y simplificar los análisis in vitro de la degradación de proteínas en entornos cuasicelulares. El método es rápido, sensible, ahorra reactivos y es apto para estudios de bajo y alto rendimiento. También es de destacar que es previsible la automatización completa de la plataforma. Por lo tanto, creemos que pDOC es una herramienta valiosa para la investigación básica y traslacional de la degradación de proteínas específicas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementarios). Los datos de origen para las Figuras y las Figuras complementarias se proporcionan en dos archivos .xlsx: Datos complementarios 1 (Figuras) y Datos complementarios 2 (Figuras complementarias).

Ruz, C., Alcantud, JL, Montero, FV, Duran, R. & Bandres-Ciga, S. Proteotoxicidad y enfermedades neurodegenerativas. En t. J. Mol. ciencia 21, 1–25 (2020).

Artículo Google Académico

Ciechanover, A. Proteolysis: Del lisosoma a la ubiquitina y el proteasoma. Nat. Rev Mol. Biol celular. 6, 79–86 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Emanuele, MJ et al. Cartografía Compleja: Regulación de Factores de Transcripción E2F por Ciclina F y Ubiquitina. Tendencias Cell Biol. 30, 640–652 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Skaar, JR & Pagano, M. Control del crecimiento celular por las ligasas de ubiquitina SCF y APC/C. actual Opinión Biol celular. 21, 816–824 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Peters, JM SCF y APC: el Yin y el Yang de la proteólisis regulada por el ciclo celular. actual Opinión Biol celular. 10, 759–768 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fuchs, SY, Spiegelman, VS & Kumar, KGS Las muchas caras de las ligasas de ubiquitina β-TrCP E3: Reflejos en el espejo mágico del cáncer. Oncogén 23, 2028–2036 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zur, A. & Brandeis, M. El momento de la degradación del sustrato APC/C está determinado por la especificidad fzy/fzr de las cajas de destrucción. EMBO J. 21, 4500–4510 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Skaar, JR, Pagan, JK & Pagano, M. Mecanismos y función del reclutamiento de sustrato por proteínas F-box. Nat. Rev Mol. Biol celular. 14, 369–381 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kernan, J., Bonacci, T. & Emanuele, MJ ¿Quién guarda al guardián? Mecanismos que restringen APC/C durante el ciclo celular. Bioquímica et. Acta Biofísica - Mol. Resolución celular 1865, 1924-1933 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Choudhury, R. et al. APC/C y SCF (ciclina F) constituyen un circuito de retroalimentación recíproca que controla la entrada de la fase S. Representante celular 16, 3359–3372 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaiser, P., Flick, K., Wittenberg, C. y Reed, SI Regulación de la transcripción por ubiquitinación sin proteólisis: inactivación mediada por Cdc34/SCF(Met30) del factor de transcripción Met4. Celda 102, 303–314 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bonacci, T. & Emanuele, MJ Degradación disidente: deubiquitinasas en el ciclo celular y el cáncer. Semin. Cáncer Biol. 67, 145–158 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Erales, J. & Coffino, P. Degradación proteasomal independiente de ubiquitina. Bioquímica et. Acta Biofísica - Mol. Resolución celular 1843, 216–221 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Murray, AW, Solomon, MJ & Kirschner, MW El papel de la síntesis y degradación de ciclinas en el control de la actividad del factor promotor de la maduración. Naturaleza 339, 280–286 (1989).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ayad, NG, Rankin, S., Ooi, D., Rape, M. & Kirschner, MW Identificación de sustratos de ubiquitina ligasa mediante clonación de expresión in vitro. Métodos Enzymol. 399, 404–414 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Nguyen, PA y col. Organización espacial de la señalización de citocinesis reconstituida en un sistema libre de células. ciencia (80-.). 346, 244–247 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Wasserman, D. et al. Osciladores del ciclo celular subyacentes a la proteólisis ordenada de E2F8. mol. Biol. Celular mbcE19120725, https://doi.org/10.1091/mbc.E19-12-0725 (2020).

Violación, M. y Kirschner, MW La regulación autónoma del complejo promotor de la anafase acopla la mitosis a la entrada en la fase S. Naturaleza 432, 588–595 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yamano, H., Gannon, J., Mahbubani, H. & Hunt, T. Reconocimiento regulado por el ciclo celular de la caja de destrucción de la ciclina B por el APC/C en extractos de huevos de Xenopus. mol. Celda 13, 137–147 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Glotzer, M., Murray, AW y Kirschner, MW La ciclina se degrada por la vía de la ubiquitina. Naturaleza 349, 132–138 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wang, W., Wu, T. & Kirschner, MW El regulador maestro del ciclo celular APC-Cdc20 regula la longitud ciliar y el desmontaje del cilio primario. Elife 3, e03083 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Khan, OM et al. La degradación proteosomal del supresor de tumores FBW7 requiere la ubiquitilación ramificada por TRIP12. Nat. común 2021 121 12, 1–14 (2021).

Google Académico

Meyer, HJ & Rape, M. Degradación mejorada de proteínas por cadenas ramificadas de ubiquitina. Celda 157, 910–921 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gerber, D., Maerkl, SJ & Quake, SR Un enfoque microfluídico in vitro para generar redes de interacción de proteínas. Nat. Métodos 6, 71–74 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Glick, Y. et al. Descubrimiento de receptores de patógenos con una matriz de proteínas de membrana humana microfluídica. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 113, 4344–4349 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Glick, Y., Avrahami, D., Michaely, E. & Gerber, D. Generador de expresión de proteínas de alto rendimiento utilizando una plataforma de microfluidos. J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/3849 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Noach-Hirsh, M. et al. Microfluídica integrada para el descubrimiento de modificación de proteínas. mol. Celúla. Proteoma. 14, 2824–2832 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Nevenzal, H. et al. Un método de microfluidos integrado de alto rendimiento permite el descubrimiento de la autofosforilación de tirosina. común Biol. 2, 1–8 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Ben-Ari, Y. et al. Integración microfluídica a gran escala del análisis de interacción viral-huésped. Lab a Chip 13, 2202–2209 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Chen, D. et al. SELMAP - MAPEO del paisaje de afinidad de SELEX de los sitios de unión del factor de transcripción utilizando microfluidos integrados. ciencia Rep. 6, (2016).

Panet, E. et al. Purificación de células citocinéticas de una población asíncrona. ciencia Rep. 5, (2015).

Wasserman, D. et al. Elucidación de humanos usando un sistema libre de células similar a la anafase. en 143–164 (Humana, Nueva York, NY, 2021). https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1538-6_11

Maerkl, SJ & Quake, SR Un enfoque de sistemas para medir los paisajes de energía vinculante de los factores de transcripción. ciencia (80-.). 315, 233–237 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Glick, Y. et al. Enfoque microfluídico integrado para mediciones cuantitativas de alto rendimiento de las afinidades de unión del factor de transcripción. Ácidos Nucleicos Res. 44, 51 (2015).

Artículo Google Académico

Wasserman, D. et al. Elucidación de humanos usando un sistema libre de células similar a la anafase. Métodos Mol. Biol. (Clifton, Nueva Jersey) 2329, 143–164 (2021). Métodos Mol Biol.

Artículo CAS Google Académico

Pe'er, T. et al. Gas2l3, una nueva proteína asociada al sitio de constricción cuya regulación está mediada por el complejo APC/CCdh1. PLoS One 8, e57532 (2013).

Wu, T. et al. UBE2S impulsa la elongación de las cadenas de ubiquitina unidas a K11 por el complejo promotor de la anafase. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 107, 1355–1360 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carrano, AC, Eytan, E., Hershko, A. y Pagano, M. Se requiere SKP2 para la degradación mediada por ubiquitina del inhibidor de CDK p27. Nat. Biol celular. 1, 193–199 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Meyer, HJ & Rape, M. Formación de cadena de ubiquitina procesiva por el complejo promotor de anafase. Semin. Biol del desarrollo celular. 22, 544–550 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Lu, Y., Lee, BH, King, RW, Finley, D. & Kirschner, MW Degradación del sustrato por el proteasoma: un análisis cinético de una sola molécula. Ciencias (80-.). 348, 1250834 (2015).

Sakaue-Sawano, A. et al. Visualización de la dinámica espaciotemporal de la progresión del ciclo celular multicelular. Celda 132, 487–498 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

McGarry, TJ & Kirschner, MW Geminin, un inhibidor de la replicación del ADN, se degrada durante la mitosis. Celda 93, 1043–1053 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a los miembros del laboratorio Gerber y Tzur por compartir reactivos. El laboratorio Tzur cuenta con el apoyo de la Fundación de Ciencias de Israel (ISF) Grant no. 2038/19. El laboratorio de Gerber cuenta con el apoyo de Imageomics FET European Grant No. 205761.

Estos autores contribuyeron igualmente: Lev Brio, Danit Wasserman.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Doron Gerber, Amit Tzur.

La Facultad de Ciencias de la Vida Mina & Everard Goodman y el Instituto de Nanotecnología y Materiales Avanzados, Universidad Bar Ilan, Ramat Gan, Israel

Lev Brio, Danit Wasserman, Efrat Michaely-Barbiro, Gal Barazany-Gal, Doron Gerber y Amit Tzur

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

investigación diseñada por LB, DW, EMB, DG y AT; LB, DW y EMB realizaron investigaciones; LB, DW, EMB, GBG, DG y AT contribuyeron con nuevos reactivos o herramientas analíticas; datos analizados por LB, DW y EMB; DW, LB, EMB, DG y AT escribieron el documento.

Correspondencia a Doron Gerber o Amit Tzur.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Todos los autores han aceptado todos los contenidos del manuscrito, la lista de autores y su orden y las declaraciones de contribución del autor.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Brio, L., Wasserman, D., Michaely-Barbiro, E. et al. Los microfluidos de afinidad permiten un análisis de degradación de proteínas de alto rendimiento en extractos sin células. Commun Biol 5, 1147 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04103-3

Descargar cita

Recibido: 27 Agosto 2021

Aceptado: 12 de octubre de 2022

Publicado: 28 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04103-3

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.