Directrices para medir especies reactivas de oxígeno y daño oxidativo en células e in vivo

Nature Metabolism volumen 4, páginas 651–662 (2022) Citar este artículo

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Las múltiples funciones de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y sus consecuencias para la salud y la enfermedad están surgiendo en las ciencias biológicas. Este desarrollo ha llevado a los investigadores que no están familiarizados con las complejidades de las ROS y sus reacciones a emplear kits y sondas comerciales para medir las ROS y el daño oxidativo de manera inapropiada, tratando a las ROS (una abreviatura genérica) como si fuera una entidad molecular discreta. Desafortunadamente, la aplicación e interpretación de estas medidas están plagadas de desafíos y limitaciones. Esto puede conducir a afirmaciones engañosas que ingresan a la literatura e impiden el progreso, a pesar de un cuerpo de conocimiento bien establecido sobre la mejor manera de evaluar las ROS individuales, sus reacciones, el papel como moléculas de señalización y el daño oxidativo que pueden causar. En esta declaración de consenso, iluminamos los problemas que pueden surgir con muchos enfoques de uso común para la medición de ROS y el daño oxidativo, y proponemos pautas para las mejores prácticas. Esperamos que estas estrategias sean útiles para aquellos que encuentran que su investigación requiere la evaluación de ROS, daño oxidativo y señalización redox en células e in vivo.

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) (Cuadro 1) están íntimamente involucradas en la señalización redox, pero en algunas situaciones también pueden provocar daño oxidativo. Por lo tanto, tienen funciones tanto fisiológicas como fisiopatológicas en biología1,2,3,4. En consecuencia, los investigadores de diversos campos a menudo necesitan medir ROS, evaluar eventos oxidativos e investigar su importancia biológica utilizando antioxidantes (Cuadro 1) o inhibidores para modular los fenómenos observados. Hay muchos ensayos y kits comerciales disponibles, pero su uso e interpretación son desafiantes y están abiertos a artefactos. Hay un campo bien establecido de biofísica/bioquímica/química que se centra en la identificación de ROS, sus reacciones químicas y productos del daño oxidativo. Sin embargo, como ocurre con muchos campos especializados, esta literatura puede ser difícil de interpretar para aquellos que trabajan fuera del área. Con frecuencia surgen problemas debido a la dependencia de kits comerciales que afirman medir 'ROS' o 'daño oxidativo', o por el uso de 'antioxidantes' en términos generales, cuando el progreso requiere la comprensión de mecanismos moleculares específicos.

Para abordar estos puntos, este grupo internacional ha establecido pautas sobre la nomenclatura y medición de ROS, reacciones oxidativas y daño oxidativo. Nuestro enfoque está en las técnicas utilizadas para medir ROS y daño oxidativo. Estos pueden aplicarse a su papel en la patología, pero también es importante tener en cuenta que los cambios en los niveles de ROS y los consiguientes cambios en la actividad de los procesos celulares sensibles a redox son fundamentales para el campo de la señalización redox1,2,3,4 . Esperamos que estas pautas sean de utilidad para los investigadores que se encuentren realizando experimentos en esta área. Estos temas, y de hecho los enfoques que defendemos, han sido cubiertos por muchas revisiones en el pasado1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 y se recomienda encarecidamente a los investigadores que lean. Aquí destilamos los puntos clave que subyacen a esta declaración de consenso.

Especies reactivas de oxígeno (ROS) es un término colectivo para las especies derivadas del O2 que son más reactivas que el propio O2. El término incluye no solo el anión radical superóxido (O2•−) y algunos otros radicales de oxígeno, sino también algunos derivados no radicales de O2 como el peróxido de hidrógeno (H2O2), el ácido hipocloroso (HOCl) y el peroxinitrito/ácido peroxinitroso (ONOO− /ONOOH). Por lo tanto, todos los radicales de oxígeno son ROS, pero no todos los ROS son especies radicales (esta última se define como una especie con uno o más electrones desapareados). 'Reactivo' es un término relativo; El O2•− y el H2O2 son selectivos en sus reacciones con las moléculas biológicas, dejando la mayoría de ellas ilesas, mientras que el •OH lo ataca todo (Tabla 1).

Antioxidante es un término que se usa con frecuencia pero es difícil de definir con claridad.

Cuando las ROS se generan in vivo, entran en juego muchos antioxidantes. Su importancia relativa depende de:

qué ROS se genera, en qué cantidades y durante qué tiempo

cómo y dónde se genera

qué objetivo de daño por ROS se mide

Una definición de antioxidante es "cualquier sustancia que retrasa, previene o elimina el daño oxidativo de una molécula diana"1. No existe un 'mejor' antioxidante universal: diferentes antioxidantes reaccionan con diferentes ROS a velocidades variables, actúan en varios lugares y protegen diferentes objetivos moleculares. Una definición alternativa es "una sustancia que reacciona con un oxidante para regular sus reacciones con otros objetivos, lo que influye en las vías de señalización biológica dependientes de redox y/o en el daño oxidativo".

Daño oxidativo: el daño biomolecular causado por el ataque de ROS sobre los constituyentes de los organismos vivos. Los niveles elevados de daño oxidativo pueden ocurrir por una mayor producción de ROS, pero también por una disminución de los procesos de reparación o eliminación, por ejemplo, la incapacidad para eliminar las proteínas oxidadas o reparar el ADN oxidado lo suficientemente rápido: ambos pueden ocurrir en ciertas enfermedades.

Biomarcador: puede definirse como cualquier sustancia, estructura o proceso que pueda medirse en el cuerpo o sus productos e influir o predecir la incidencia de un resultado o enfermedad54.

Un problema que subyace en la medición de ROS y daño oxidativo y el uso de 'antioxidantes' es la falta de precisión en el uso de estos términos. ROS es una abreviatura que cubre una amplia gama de especies químicas con diferentes propiedades, reactividades e interacciones (Cuadro 1, Tabla 1). Por ejemplo, una especie reactiva importante que se encuentra en biología, el anión radical superóxido (O2•−), se forma por la reducción de un electrón del oxígeno (O2). En sí mismo, el O2•− es poco reactivo, excepto con otro radical óxido nítrico (•NO) para formar peroxinitrito11, o con clusters de Fe–S en proteínas12. Asimismo, el peróxido de hidrógeno (H2O2), formado por diversas enzimas oxidasas1,4 y por acción de la superóxido dismutasa (SOD), es poco reactivo, lo que permite su uso como una importante molécula señalizadora in vivo2,4. Sin embargo, en presencia de iones ferrosos o cuprosos, el H2O2 forma el radical hidroxilo extremadamente reactivo (•OH) por la química de Fenton: •OH reacciona de manera no específica y esencialmente instantánea con cualquier biomolécula cercana (Tabla 1)1,13. La disponibilidad de iones de metales de transición para catalizar la química de Fenton se controla cuidadosamente in vivo1, pero estos pueden liberarse por lesión tisular o cuando ciertas proteínas con grupos de Fe-S encuentran O2•− (refs. 1, 12, 14). Su importancia in vivo ha sido subrayada recientemente por la creciente literatura sobre ferroptosis, una forma de muerte celular que involucra iones de hierro 'catalíticos'15. El H2O2 es un sustrato para las hemoperoxidasas, como la mieloperoxidasa, que genera otras especies reactivas, como el HOCl (Tabla 1). A pesar de su pobre reactividad general, el H2O2 puede oxidar selectivamente algunos residuos de metionina (Met) y cisteína (Cys)16,17 en ciertas proteínas.

En la Tabla 1 se proporciona una lista (lejos de ser completa) de las propiedades fisicoquímicas de las ROS más comunes que se encuentran en biología, que brinda información sobre qué reacciones podrían ser plausibles in vivo cuando se generan estas especies. Lo que también debería ser evidente es que 'reactivo' depende en gran medida del contexto, porque la reactividad de diferentes ROS varía en una amplia escala, al igual que su vida útil, capacidad de difusión y potencial para generar más especies reactivas aguas abajo. En definitiva, no todos los ROS son iguales. La generalización 'ROS', aunque se usa ampliamente (¡incluso en este artículo!) no brinda información sobre las especies químicas reales que causan el efecto observado. Recomendación 1: siempre que sea posible, se deben indicar las especies químicas reales involucradas en un proceso biológico y se debe considerar si el efecto observado es compatible con su reactividad, vida útil, productos generados y destino in vivo. Si esto no es posible, se deben discutir las advertencias sobre el uso del término 'ROS'.

Una amplia gama de antioxidantes está presente en biología. Estos incluyen enzimas y moléculas pequeñas que reaccionan con ROS individuales para disminuir el daño oxidativo y/o modular la señalización redox1,2. Al igual que con 'ROS', el uso de 'antioxidante' como término general puede ser impreciso y engañoso (Cuadro 1). A menudo, el efecto de un supuesto antioxidante en un resultado biológico se usa para inferir el papel de una ROS, como si todos los antioxidantes fueran equivalentes. Sin embargo, cada antioxidante tiene su propia química y reactividad específicas con diferentes ROS. Además, los principales antioxidantes in vivo son sistemas enzimáticos como SOD para O2•−, peroxidasas para H2O2 y secuestro de iones metálicos1,14. La mayoría de los compuestos de baja masa molecular comúnmente empleados como "antioxidantes" son eliminadores estequiométricos de ciertos ROS y, a menudo, tienen una reactividad modesta (si la tienen) con O2•− o H2O2. Por ejemplo, la N-acetilcisteína (NAC) es un 'antioxidante' ampliamente utilizado pero tiene otros modos de acción (ya veces más importantes18). De hecho, la NAC puede eliminar algunas ROS in vitro, pero no otras, sobre todo H2O2 (ref. 18). También puede aumentar la reserva celular de Cys y, por lo tanto, mejorar los niveles de glutatión (GSH), generar H2S y escindir directamente los disulfuros de proteínas18. Los compuestos de baja masa molecular que actúan como antioxidantes in vivo incluyen la vitamina E, que elimina los radicales peroxilo lipídicos19. A veces, se utilizan 'eliminadores de •OH' para inferir un papel para este ROS, pero rara vez, si es que lo hacen, pueden alcanzar una concentración suficientemente alta para evitar la reacción instantánea efectiva de •OH con biomoléculas1,7,13. En consecuencia, muchos de los efectos biológicos asignados a los 'antioxidantes', especialmente a la NAC, se deben a otros efectos. Otros agentes que se utilizan a menudo como "antioxidantes", como TEMPO/TEMPOL, mito-TEMPO y "miméticos de SOD" a base de porfirina, experimentan reacciones redox complejas in vivo y se describen mejor como "moduladores redox" que como "antioxidantes" o "O2". •− carroñeros'1,20,21. Recomendación 2: para que una intervención se atribuya a una actividad antioxidante, se debe hacer explícita la especie química específica a la que se dirige el 'antioxidante'. Debe reconocerse que es poco probable que los 'antioxidantes' de baja masa molecular actúen eliminando H2O2. La especificidad, la constante de velocidad, la ubicación y la concentración del antioxidante dentro de la célula deberían hacer plausible químicamente un efecto antioxidante. Siempre que sea posible, la actividad del antioxidante debe confirmarse midiendo una disminución del daño oxidativo.

Un procedimiento clave para atribuir el daño oxidativo, o la activación de una vía de señalización redox, a un ROS en particular puede ser mediante la generación selectiva del ROS en un contexto biológico. Esto se puede hacer mediante el uso de compuestos de ciclos redox como el paraquat (PQ) o las quinonas para generar O2•−, o MitoPQ para generar O2•− dentro de las mitocondrias1,22. Por supuesto, una mayor generación de O2•− también aumentará la producción de H2O2 por dismutación de O2•−. La glucosa oxidasa se puede usar para generar H2O2 directamente in vitro, mientras que la generación regulada de H2O2 dentro de las células se puede lograr usando la d-aminoácido oxidasa expresada genéticamente, una enzima que genera H2O2 a medida que oxida los d-aminoácidos23. Puede dirigirse a diferentes sitios de la célula y regular el flujo variando la concentración añadida de su sustrato, d-alanina23. Las enzimas NADPH oxidasa (NOX) son fuentes importantes de O2•− y H2O2 para la señalización redox, así como para el daño oxidativo9,24, y la modulación de su actividad es un enfoque importante para comprender estos procesos. Se han descrito varios inhibidores bastante específicos de las enzimas NOX24. Sin embargo, el uso de compuestos como la apocinina y el difenilenoyodonio como 'inhibidores de NOX' todavía está muy extendido, aunque su falta de especificidad está bien establecida1,24. Recomendación 3: recomendamos el uso de PQ, quinonas y MitoPQ para la generación selectiva de O2•− y la expresión celular de d-aminoácido oxidasa para la generación controlada de H2O2. Evitar el uso de la inhibición de un fenómeno por la apocinina o el difenilenoyodonio como única evidencia del papel de las enzimas NOX, o al menos discutir su falta de especificidad. Se deben usar inhibidores específicos24 o la eliminación o eliminación de los componentes de NOX para identificar sus funciones.

Al investigar ROS en sistemas biológicos, es importante detectar y cuantificar las ROS de interés. Esto se puede hacer usando resonancia paramagnética (espín) de electrones (EPR/ESR), varias moléculas de sonda o midiendo las modificaciones oxidativas ("daño oxidativo", cuadro 1) causadas por ROS1. La mayoría de las sondas de ROS capturan solo un pequeño porcentaje de cualquier ROS formado. De hecho, si la sonda reaccionara con la mayoría de las ROS generadas, esto perturbaría el sistema y afectaría los resultados experimentales (por ejemplo, la inhibición del daño oxidativo o la interferencia con la señalización redox). Sin embargo, es importante que el porcentaje de captura permanezca aproximadamente constante a diferentes tasas de producción de las ROS en cuestión.

El daño oxidativo puede tomar muchas formas; los procesos químicos por los que surge de un ROS en particular y cómo se evalúa y cuantifica son complejos. Además, el nivel final de cualquier biomarcador de daño oxidativo medido es la diferencia entre su tasa de producción y su eliminación por reparación, degradación, excreción o difusión. Recomendación 4: cuando se presenten niveles de daño oxidativo a alguna biomolécula, se deben hacer explícitos los procesos químicos por los cuales se originan y los métodos utilizados para cuantificarlos. Se debe considerar y discutir el impacto de la reparación y la limpieza en los niveles finales medidos.

La consideración de ROS, antioxidantes y daño oxidativo como conceptos monolíticos limita la precisión y la interpretación de los experimentos y pasa por alto la necesidad de establecer mecanismos moleculares precisos. La puesta en práctica de estos preceptos requiere la medición de ROS específicos y/o productos de daño oxidativo, así como los efectos de los antioxidantes. Este es un gran desafío práctico, porque la mayoría de las ERO tienen una vida corta (duración de milisegundos o menos) y sus niveles de estado estacionario son bajos (picomolar a micromolar bajo) y se alteran rápidamente, porque se ven afectados por tasas de generación continuamente variables, químicas. reacción y difusión.

En sistemas in vitro simples es posible detectar varias ROS (Tabla 2). Por ejemplo, la producción de O2•− puede controlarse mediante la reducción del citocromo c, y su selectividad puede evaluarse mediante la inhibición por SOD añadida. Sin embargo, incluso un sistema tan 'simple' puede ser sorprendentemente complejo. Por ejemplo, las semiquinonas pueden reducir el citocromo c en una reacción inhibida por SOD25. La conclusión es que todos los métodos utilizados para evaluar ROS son susceptibles de artefactos, y se requieren controles apropiados para estar seguros de las especies y cantidades medidas. Por lo tanto, es importante corroborar las mediciones con "técnicas ortogonales" que se basan en un enfoque alternativo que utiliza un método de detección diferente para evitar artefactos específicos del método. Estas complejidades se magnifican cuando uno intenta medir ROS en las células. Las condiciones de cultivo celular comúnmente utilizadas promueven el daño oxidativo debido a los antioxidantes limitados en las concentraciones medias y altas de O2 en relación con las in vivo26. En consecuencia, las células cultivadas generan más ROS que estas células in vivo.

Recomendación 5: use kits comerciales solo si las especies reales que se están midiendo y el método de detección se explican en los materiales del kit, son químicamente plausibles y se comprenden las limitaciones. Se desaconseja encarecidamente el uso de kits comerciales sin dicha información. Para evitar artefactos específicos del método, confirme los resultados utilizando técnicas que se basen en diferentes principios de detección.

Las sondas fluorescentes de molécula pequeña se utilizan con frecuencia para evaluar ROS dentro de las células. En algunos casos, a menudo relacionados con kits, la falta de descripción de la reactividad química o las estructuras de estas sondas dificulta la interpretación de los resultados y, por lo tanto, se deben evitar dichas sondas. Incluso para sondas de estructura conocida puede haber problemas. Considere la sonda fluorescente ampliamente utilizada 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH), generalmente administrada en su forma de diacetato (DCFH-DA), que ingresa fácilmente a las células. DCFH se oxida al producto fluorescente 2',7'-diclorofluoresceína (DCF) por varias ROS, por lo que no es específico para ninguna ROS6,7 en particular. DCFH no se oxida directamente por H2O2 (que a menudo se afirma que detecta), sino solo después de que H2O2 se convierte en especies más reactivas por metales redox activos o por proteínas hemo como el citocromo c o las peroxidasas. Además, la oxidación de DCFH y la fluorescencia de DCF son sensibles a los niveles locales de O2 y al pH, y el rendimiento de la fluorescencia puede no ser lineal con el aumento de los niveles de ROS27,28,29. Esto no quiere decir que DCFH y otras sondas fluorescentes no específicas como la dihidrorodamina nunca deban usarse, pero sus limitaciones (selectividad, problemas de cuantificación, linealidad de respuesta y susceptibilidad al artefacto) deben entenderse e interpretarse los resultados con cautela28. En particular, su respuesta no debe atribuirse a un ROS específico sin controles detallados para validarlo, y su uso debe restringirse a una evaluación inicial de un cambio en el estado redox celular, seguido de una investigación más detallada del mecanismo. Si bien muchas sondas fluorescentes de proteínas y moléculas pequeñas son más selectivas que DCF, siempre es importante validar los datos mediante una serie de controles simples: ¿cambia la respuesta con el tiempo y con la cantidad de muestra biológica de manera plausible? ¿Se puede replicar el efecto generando las ROS de interés (por ejemplo, usando PQ para O2•− o d-aminoácido oxidasa para H2O2)? ¿Los controles negativos que deberían abolir el proceso de generación de ROS (por ejemplo, knockouts de genes, knockdowns, inhibidores, captadores de radicales) responden como se esperaba? Recomendación 6: cuando se utilizan sondas ROS fluorescentes (especialmente DCFH-DA), la química involucrada, la selectividad para especies químicas particulares y los artefactos potenciales deben aclararse y discutirse. Siempre que sea posible, se deben realizar controles para demostrar que la respuesta se debe a la especie propuesta y utilizar técnicas ortogonales para corroborar la conclusión.

Es vital extender las mediciones de ROS de células en cultivo a tejidos in vivo o ex vivo. Sin embargo, en algunos casos, esta brecha se ha abordado mediante la adición de "sondas ROS" a cortes de tejido frescos o previamente congelados u homogeneizados ex vivo. Estas mediciones pueden no tener sentido, porque la vida útil muy corta de ROS significa que cualquier presente in vivo habrá desaparecido hace mucho tiempo en el momento en que se analice el material. Además, la congelación o la homogeneización rompen las membranas y alteran las concentraciones de iones y sustratos (por ejemplo, elevando los niveles de Ca2+ o Fe2+ 'catalítico')1, de modo que cualquier producción de ROS en la rebanada de tejido o en el homogeneizado no tiene relación con los niveles que se habrían obtenido. generado en vivo. Hay métodos válidos disponibles para evaluar ROS in vivo o en órganos perfundidos, pero en estas situaciones el proceso se monitorea in vivo (por ejemplo, consulte la Tabla 2 para el uso del compuesto de catalasa I para medir H2O2) o el sistema se apaga para estabilizar la sonda para el análisis ex vivo. Recomendación 7: las mediciones de ROS deben realizarse en células, tejidos u órganos en condiciones fisiológicamente relevantes in vivo o ex vivo. Las ROS no deben "medirse" en homogeneizados de tejido o criosecciones, a menos que la sonda o el sensor empleado sea capaz de capturar de forma irreversible las especies reactivas cuando las células/tejidos/órganos se encuentran en condiciones biológicamente relevantes.

Aquí describimos lo que consideramos, actualmente, los mejores enfoques para la medición de ROS comúnmente encontrados.

En sistemas simples, el O2•− se puede medir de varias maneras, como por medio de la reducción del citocromo c inhibible por la SOD (ref. 25). La generación de O2•− también se puede evaluar mediante atrapamiento de espín seguido de EPR, que tiene la ventaja de la detección directa del radical1. El grupo Fe–S en la aconitasa es inactivado por O2•− y por otras ROS, pero su interacción con O2•− es rápida, razonablemente específica y reversible, lo que lo convierte en un buen indicador de O2•− en las mitocondrias30. Las 'sondas de superóxido' quimioluminiscentes, luminol y lucigenina, se usan ampliamente para 'detectar O2•−', pero la interpretación de tales datos es difícil porque estas sondas generan radicales que producen O2•− por sí mismas; no reaccionan con el O2•− directamente31,32.

Recomendación 8: se debe desaconsejar el uso de luminol y lucigenina para 'detectar O2•−', pero pueden usarse como indicadores generales de una mayor producción de ROS. La reducción sensible a SOD del citocromo c in vitro y la inactivación de la aconitasa dentro de las mitocondrias son mejores estrategias.

En las células, el O2•− suele detectarse midiendo la fluorescencia que surge de la oxidación del dihidroetidio (a veces llamado hidroetidina (HE)) o HE dirigido a las mitocondrias (MitoSOX). Desafortunadamente, la detección por fluorescencia es engañosa porque estas sondas forman tanto etidio (E+), un producto de oxidación no específico, como el producto 2-hidroxietidio específico para O2•−. Debido a que estos dos productos tienen espectros de fluorescencia superpuestos, es difícil diferenciar la contribución de la oxidación no específica y la oxidación dependiente de O2•− (si la hay) a la fluorescencia general33. La cuantificación precisa del producto de 2-hidroxietidio se puede lograr mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS)33. Otro factor que debe tenerse en cuenta es el grado de captación celular de HE/MitoSOX y las concentraciones intracelulares de estos y sus múltiples productos. Además, los productos de oxidación HE se intercalan en el ADN, lo que aumenta en gran medida su fluorescencia y crea otro artefacto. NeoD y MitoNeoD contienen un HE modificado que no se intercala en DNA34.

Las sondas de O2•− acumuladas mitocondrialmente, como MitoSOX, se utilizan a menudo para 'detectar O2•−' dentro de las mitocondrias. Cuando se utilizan estas sondas y otras que tienen cargas positivas o generan especies cargadas positivamente (incluidos 2-hidroxietidio y etidio), es importante recordar que la acumulación de sondas depende de los potenciales de membrana plasmática y mitocondrial y del tamaño, la forma y la masa mitocondrial35. Además, la fluorescencia se puede extinguir cuando están presentes en altas concentraciones en las mitocondrias36.

Recomendación 9: utilice únicamente sondas HE o MitoSOX para detectar O2•−mediante mediciones simples de fluorescencia cuando el producto haya sido validado de forma independiente como 2-hidroxietidio. Las mediciones de fluorescencia con sondas como dihidroetidio y MitoSOX33 deben realizarse utilizando la concentración de sonda más baja posible, y deben incluir controles para los cambios en el plasma y los potenciales de membrana mitocondrial y la masa y morfología mitocondrial, como la normalización a un potencial de membrana similar sensible, pero insensible a redox, sonda. Siempre que sea posible, se deben aplicar métodos de LC-MS, que miden todas las especies modificadas33.

En sistemas simples, el H2O2 se puede medir mediante sustratos oxidantes de peroxidasa de rábano picante (HRP), uno de los cuales se usa con frecuencia como Amplex Red. Estos métodos pueden verse interferidos por otros sustratos de HRP (por ejemplo, ascorbato y NAC)1 y por O2•− (que puede inactivar HRP), este último prevenible mediante la adición de SOD37. Dado que el H2O2 puede atravesar las membranas directamente o mediante acuaporinas, este sistema también se puede utilizar para medir la liberación de H2O2 de las células. Sin embargo, tenga en cuenta que esta liberación refleja el equilibrio entre la producción de H2O2, la eliminación por enzimas intracelulares y la tasa de difusión fuera de la célula.

Dentro de las células, la detección de H2O2 mediante sondas basadas en fenilboronato es más fiable38, aunque es posible que carezcan de la suficiente sensibilidad porque reaccionan lentamente con el H2O2, lo que puede dificultar la detección de cambios pequeños o localizados en los niveles de H2O239. Sin embargo, estudios recientes sugieren que los ácidos borínicos, que reaccionan más rápidamente con el H2O2, pueden ser detectores más sensibles40. El mecanismo de oxidación de los fenilboronatos a fenoles requiere un oxidante de dos electrones, como el H2O2. Debido a que el H2O2 generalmente se genera en concentraciones más altas que otras ROS, las sondas de boronato pueden ser selectivas para la detección de H2O2 sujetas a los controles adecuados39,40. Sin embargo, las sondas de boronato reaccionan con ONOO−/ONOOH o HOCl mucho más rápido que con H2O2, lo que a veces puede complicar las mediciones, y los enfoques ortogonales o el uso de inhibidores pueden ayudar a la validación41. Por ejemplo, las señales dependientes de H2O2 y peroxinitrito se pueden distinguir usando inhibidores de óxido nítrico sintasa (NOS) y catalasa38,39,41,42.

Los sensores de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente han proporcionado importantes avances en la detección de H2O2 celular43,44,45,46. Estas sondas contienen un interruptor de ditiol que cambia la fluorescencia general de la sonda según su estado de oxidación. Se ha logrado una alta sensibilidad y especificidad para H2O2 acoplando un mutante de proteína verde fluorescente (GFP) sensible a redox con una proteína tiol sensible a H2O2, como oxyR (serie HyPer), o con una peroxidasa como Orp1 o TSA2 (roGFP2- sondas basadas). HyPer7 y roGFP2 acoplados a una peroxirredoxina proporcionan la mayor sensibilidad44,45. Si bien las sondas basadas en HyPer7 y roGFP2 son estables al pH, las versiones anteriores de HyPer no lo son y requieren la expresión de una sonda de control (SypHer) para controlar los cambios de señal debido a la variación en el pH43. Normalmente se emplea el análisis de imágenes por microscopía de fluorescencia, pero también se pueden utilizar lectores de placas de fluorescencia. El estado redox medido representa un equilibrio entre la tasa de oxidación y la re-reducción de las sondas por reductores celulares, incluyendo glutaredoxina/GSH y tiorredoxina, lo que permite evaluaciones del estado redox en tiempo real con células vivas. Debido a que se utilizan longitudes de onda de excitación de sondas tanto reducidas como oxidadas, las sondas son radiométricas y la salida no depende del nivel de expresión de la sonda de proteína. Mediante la incorporación de secuencias genéticas dirigidas apropiadas, estas sondas pueden dirigirse a diferentes compartimentos celulares, incluidas las mitocondrias, los microtúbulos, el retículo endoplásmico, el núcleo y el citoplasma43,44,45,46. Por lo tanto, se pueden estudiar las regiones subcelulares de interés y luego calibrar la sonda al final mediante reducción total (ditiotreitol 2 mM), lavado y oxidación total (hidroperóxido de t-butilo 2 mM)44,45. Esta calibración produce una medida del porcentaje de oxidación, lo que permite realizar comparaciones entre experimentos y entre compartimentos subcelulares44,45. Estas sondas se han expresado en animales transgénicos para proporcionar evaluaciones útiles de las generaciones de H2O2 in vivo46,47. La transfección de plásmidos de vectores virales se puede utilizar con células cultivadas, y las sondas de roGFP2 dirigidas están disponibles comercialmente (www.addgene.com).

En la mayoría de los experimentos, las sondas de H2O2 se expresan como proteínas libres que se distribuyen dentro de la célula. Sin embargo, dadas las incertidumbres sobre las distancias de difusión del H2O2 intracelular, aún no está claro qué resolución se necesita para comprender la distribución del H2O2 subcelular. Por lo tanto, unir sondas de H2O2 a ubicaciones subcompartimentales, como complejos de proteínas o sitios de contacto con orgánulos, es un enfoque importante.

Recomendación 10: las sondas fluorescentes codificadas genéticamente (algunas de las cuales están disponibles comercialmente) son actualmente los detectores más sensibles de H2O2 y recomendamos su uso en células y animales si es posible su expresión. Las sondas de boronato (algunas de las cuales también están disponibles comercialmente) son las sondas de molécula pequeña preferidas, pero se requieren controles para determinar la especificidad para H2O2 y la sensibilidad es limitada para los niveles fisiológicos de H2O2. Amplex Red con HRP puede medir la liberación de H2O2 de las células si no hay otros agentes reductores o sustratos de peroxidasa.

El peroxinitrito (ONOO-) exhibe una química compleja42,48,49 y en sí mismo puede oxidar ciertas biomoléculas. Una reacción fisiológica importante es con el CO2 (Tabla 1) y, por lo tanto, el contenido de CO2/ \({{{\mathrm{HCO}}}}_3^{- }\) de los sistemas biológicos juega un papel en la determinación del impacto biológico50 de ONOO−. Los productos de esta reacción incluyen especies reactivas como el anión radical carbonato (CO3•−) y el agente nitrante dióxido de nitrógeno (NO2•) (Tabla 1), los cuales reaccionan con muchas de las 'sondas ROS' generales. El peroxinitrito oxida las sondas a base de boronato casi un millón de veces más rápido que el H2O2 y, en las condiciones adecuadas, estas sondas se pueden utilizar para evaluar la producción de ONOO−/ONOOH42,49. El peroxinitrito se ha medido en tejidos ex vivo utilizando sondas de boronato51.

El HOCl, el ácido hipobromoso (HOBr) y algunas de las cloraminas y bromaminas derivadas de ellos (Tabla 1) reaccionan con la mayoría de las sondas generales utilizadas para detectar ROS, incluidos DCFH y luminol. Sin embargo, muchas de estas sondas también son sustratos de las peroxidasas que generan HOCl o HOBr, lo que confunde su uso. Se han informado sondas fluorescentes más específicas para especies halógenas reactivas y algunas están disponibles comercialmente52. Se ha desarrollado una sonda codificada genéticamente para especies de halógenos reactivos, lo que permite el seguimiento dinámico de estas especies tanto en cultivo celular como in vivo53.

La presencia de ROS puede inferirse por sus efectos sobre proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y lípidos para generar compuestos específicos que, siempre que no puedan formarse por otros mecanismos, pueden usarse como 'biomarcadores' de daño oxidativo (Cuadro 1) 1,54,55. Sin embargo, tenga en cuenta que los niveles medidos de biomarcadores representan un equilibrio entre la generación y la eliminación del biomarcador (por ejemplo, por degradación, difusión o excreción), más cualquier aumento de los niveles causado por el daño oxidativo durante el aislamiento o el análisis.

Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) se oxidan fácilmente y, por lo tanto, los productos de peroxidación de lípidos se usan ampliamente para caracterizar el daño oxidativo56,57,58. La peroxidación de lípidos puede ser iniciada por ciertas ROS y proceder como un proceso radical aleatorio, no enzimático (a menudo en cadena). Sin embargo, también existen mecanismos enzimáticos (por ejemplo, lipoxigenasas) disponibles para la peroxidación de PUFA libres o PUFA-fosfolípidos que producen productos de señalización específicos con funciones biológicas. Por lo tanto, al medir la peroxidación de lípidos, el enfoque podría centrarse en (1) el establecimiento de una mayor peroxidación de lípidos como un ejemplo de daño oxidativo o (2) la identificación de moléculas de lípidos modificadas oxidativamente individuales que actúan como señales mediante la interacción selectiva con ciertos objetivos celulares.

En los PUFA, la presencia de un doble enlace adyacente a un grupo metileno hace que el enlace C-H del metileno sea más débil y, por lo tanto, el hidrógeno bis-alílico es más susceptible a la abstracción de H•56,57,58. El radical centrado en el carbono (L) generado por la abstracción de H• se estabiliza por deslocalización sobre los dobles enlaces. La reacción posterior con O2 da un radical peroxilo (LOO) con la formación de un sistema dieno conjugado y una variedad de peróxidos (LOOH). LOO• puede reaccionar aún más para producir productos secundarios altamente oxidados, incluidos los peróxidos epoxi, oxo o cíclico56,57,58. Por lo tanto, existen múltiples productos finales de la peroxidación lipídica que muestran una gran heterogeneidad química y una estabilidad y polaridad variables y, por lo tanto, la medición de un solo producto de oxidación de ninguna manera representa todo el proceso de peroxidación lipídica.

Hay varios métodos disponibles para evaluar la peroxidación lipídica 'general'. En sistemas modelo simples (por ejemplo, lipoproteínas aisladas), la conjugación de dienos se puede medir mediante absorbancia ultravioleta (UV), pero este método no es adecuado para su uso en células o fluidos corporales debido a la presencia de moléculas absorbentes de UV que interfieren y que no resultan de la peroxidación lipídica1. En las células, la 'peroxidación de lípidos' se puede evaluar mediante cambios en la fluorescencia de BODIPY conjugado con un resto de ácido undecanoico sensible a la peroxidación59. Este ensayo es técnicamente simple, pero debe interpretarse con cautela porque la velocidad de reacción de BODIPY con los radicales peroxilo es más lenta que la de los antioxidantes que eliminan radicales y, por lo tanto, la supresión de la fluorescencia de BODIPY por parte de los antioxidantes no siempre refleja su capacidad para suprimir la peroxidación lipídica59. Otro ensayo fluorométrico para la peroxidación de lípidos emplea ácido cis-parinárico (PnA), un ácido graso con cuatro dobles enlaces conjugados. La oxidación de PnA interrumpe su sistema conjugado y, por lo tanto, la fluorescencia. Debido a que la PnA puede incorporarse a diferentes clases de fosfolípidos, la separación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) brinda información sobre la oxidación de diferentes fosfolípidos60. Sin embargo, la extrapolación de los resultados basados ​​en PnA a la oxidación de fosfolípidos endógenos es difícil debido a la mayor tasa de oxidación de PnA, su vulnerabilidad al fotoblanqueo y la incorporación metabólica variable de PnA en diferentes fosfolípidos60.

La peroxidación de lípidos se evalúa con frecuencia mediante la medición de productos finales como los hidroxialquenales α, β-insaturados61, idealmente mediante técnicas basadas en MS. En particular, se ha utilizado ampliamente la formación de 4-hidroxinonenal (HNE). Los anticuerpos contra los aductos de proteínas formados por HNE están ampliamente disponibles y se usan con frecuencia en la inmunotinción de tejidos, pero debe tenerse en cuenta que diferentes anticuerpos pueden detectar diferentes epítopos y, por lo tanto, dar diferentes respuestas, dependiendo de a qué residuos de aminoácidos se une la HNE en las proteínas61, 62,63,64.

Un producto final secundario de la peroxidación lipídica es el malondialdehído (MDA)61, que también puede ser un biomarcador útil si se mide mediante técnicas de EM. Sin embargo, los 'ensayos MDA' ampliamente utilizados que utilizan sustancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (TBARS) no son específicos, ya que TBA genera cromógenos a partir de muchas biomoléculas distintas de MDA1,65. El uso de HPLC para separar el aducto 'real' TBA-MDA de los cromógenos falsos aumenta la especificidad pero no elimina todos los problemas1.

Recomendación 11: no se recomienda la aplicación de la prueba TBA simple (TBARS), o kits basados ​​en su uso, a células, tejidos o fluidos corporales como la única prueba utilizada para la evaluación del daño lipídico oxidativo debido a la baja especificidad que puede resultar en resultados falsos positivos. Las pruebas TBA basadas en HPLC son menos propensas a artefactos.

La detección de productos de oxidación de lípidos se ha visto revolucionada por el desarrollo de LC-MS para el análisis detallado de mezclas de lípidos oxidados66. La recolección y el almacenamiento de muestras para evitar la peroxidación artificial es clave para cualquier estudio de peroxidación lipídica, y las muestras para análisis posteriores deben congelarse inmediatamente en nitrógeno líquido. Los biofluidos pueden requerir la adición de productos químicos (por ejemplo, hidroxitolueno butilado) para evitar la autooxidación durante el almacenamiento1,67. Los estándares internos utilizados para la cuantificación deben agregarse a las muestras antes de la extracción con solventes. Dichos métodos basados ​​en LC-MS tienen las ventajas de una alta sensibilidad, requisitos de volumen de muestra pequeño y la capacidad de detectar múltiples productos finales de peroxidación lipídica. Esto hace que los protocolos LC-MS sean los métodos de elección para la evaluación de la peroxidación lipídica general y la identificación de productos individuales, incluidos aquellos con funciones de señalización específicas. Sin embargo, las limitaciones de los estándares disponibles a veces pueden impedir el análisis cuantitativo de ciertos productos. En tales estudios se requiere una atención escrupulosa a la metodología68.

Entre los productos de oxidación de lípidos que se han cuantificado mediante enfoques basados ​​en MS, destacan los isoprostanos F2 (F2-IsoP)69. Sesenta y cuatro estereoisómeros F2-IsoP pueden generarse a partir de la oxidación no enzimática inducida por radicales libres del ácido araquidónico y pueden separarse de los que surgen de la oxidación enzimática del ácido araquidónico por las enzimas ciclooxigenasas (COX-1/ -2). Los isoprostanos F3 y F4 surgen del ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido docosahexaenoico (DHA), respectivamente, pero se han caracterizado menos que los isoprostanos F2. Se han desarrollado métodos ELISA para cuantificar un isómero F2-IsoP, 8-iso-PGF2α (también conocido como 15-F2t-IsoP o iPF2α-III), y compararlos con cromatografía de gases-MS y LC-MS en tándem (LC-MS /MS) métodos69,70,71,72,73. En todos estos estudios hubo poca concordancia entre los kits ELISA disponibles en el mercado y los métodos de EM; 8-iso-PGF2α es uno de los 64 isómeros F2-IsoP diferentes generados durante la peroxidación del ácido araquidónico, y la reactividad cruzada de anticuerpos entre 8-iso-PGF2α y los isómeros relacionados es un desafío. La limpieza de la muestra previa al análisis puede permitir una medición más precisa de 8-iso-PGF2α mediante ELISA72,73, pero, con diferencia, el método más preciso para la cuantificación de F2-IsoP es mediante LC-MS/MS y se recomienda enfáticamente.

Recomendación 12: Los F2-IsoP son un biomarcador generalmente aceptado de peroxidación lipídica, pero se debe tener en cuenta que son uno de muchos productos finales y que los niveles de varios tipos pueden verse afectados por las condiciones experimentales69. La cuantificación mediante ELISA es susceptible a artefactos, pero la limpieza de la muestra puede permitir la medición de 8-iso-PGF2α mediante ELISA73. LC-MS/MS con estándares internos apropiados es el enfoque preferido.

Los residuos de aminoácidos en las proteínas son sensibles a la modificación oxidativa, algunas de las cuales proporcionan biomarcadores útiles74,75. Los protocolos detallados para la medición de múltiples productos se pueden encontrar en las refs. 76,77. Una modificación común de proteínas es la formación de 'carbonilos de proteínas' debido a la oxidación de residuos de aminoácidos específicos a productos que contienen grupos carbonilo; los carbonilos también pueden formarse por la reacción de aldehídos con sitios nucleofílicos en proteínas o por glicación75,77. Muchos ensayos implican la derivatización del grupo carbonilo con 2,4-dinitrofenilhidracina para formar una dinitrofenilhidrazona (DNP). Este producto puede detectarse espectrofotométricamente, aunque este enfoque puede tener un fondo alto y una reproducibilidad baja; para evitar esto, los aductos de DNP se pueden separar por LC antes de la medición. Alternativamente, los carbonilos se pueden detectar utilizando un anticuerpo contra los productos DNP mediante ELISA o inmunotransferencia78. Los cambios en los carbonilos de proteínas se pueden medir en homogeneizados de tejido tratados con fluoresceína-5-tiosemicarbazida (FTC) para generar proteínas marcadas con fluoróforo que se pueden separar mediante electroforesis en gel79. Se han desarrollado métodos de enriquecimiento que utilizan derivatización marcada con biotina junto con detección LC-MS80. Los carbonilos de proteínas, el semialdehído α-aminoadípico y el semialdehído glutámico también se han analizado individualmente mediante análisis de dilución isotópica estable LC-MS/MS77. Por supuesto, los datos de un solo momento reflejan la diferencia entre las tasas de formación y eliminación (por ejemplo, por reparación o proteólisis) de estos productos.

El análisis de proteínas mediante MS permite la detección e identificación de modificaciones con aumentos de masa característicos (por ejemplo, hidroxilación, nitración y cloración)75,76. Esto ha sido particularmente útil en estudios de daño oxidativo a proteínas cerebrales en pacientes con demencia mediante 'proteómica redox'81. El mapeo de niveles de péptidos después de la escisión proteolítica permite la detección de la naturaleza de la modificación, su ubicación dentro de la secuencia de la proteína y la pérdida concomitante del péptido original, lo que permite la cuantificación relativa. El análisis de aminoácidos después de la digestión completa permite la determinación de tipos y concentraciones absolutas de especies particulares (determinadas mediante el uso de estándares marcados con isótopos) junto con las especies originales, lo que permite la determinación de un "balance de masa"75,76,77,82. Se debe tener cuidado en la manipulación de muestras para evitar la oxidación artificial de Cys o Met, y también durante la hidrólisis de proteínas, porque algunos productos del daño oxidativo de proteínas son lábiles. Los análisis de LC-MS tienen muchas ventajas, incluida la alta especificidad, la alta sensibilidad, la capacidad de detectar muchas modificaciones diferentes y especies originales al mismo tiempo, así como la capacidad de detectar productos que son diagnósticos de las ROS involucradas, como la cloración de HOCl83 y especies nitradas. derivados de la acción de la mieloperoxidasa en presencia de NO2− y/o por reacciones de ONOO−/ONOOH49,84). Estos enfoques de LC-MS se pueden llevar a cabo en materiales que van desde proteínas aisladas hasta muestras de tejido. Se recomienda la cuantificación relativa a aminoácidos o péptidos no modificados, y preferiblemente frente a materiales marcados con isótopos pesados ​​añadidos, para superar los posibles artefactos que surgen de la manipulación y preparación de muestras. Sin embargo, tenga en cuenta que los niveles urinarios y plasmáticos de aminoácidos oxidados pueden contribuir a la absorción de aminoácidos oxidados de las proteínas de los alimentos o al aumento de la proteólisis tisular como resultado de una patología. Ninguno de estos ha sido estudiado en detalle.

La cisteína es un objetivo importante para la modificación debido a su facilidad de oxidación (particularmente en su forma de tiolato, RS-) y su nucleofilia, lo que da como resultado la formación de aductos con electrófilos. La oxidación puede ser irreversible, por ejemplo, a un ácido sulfínico o sulfónico, que pueden ser biomarcadores útiles del daño oxidativo de las proteínas4,85. La oxidación reversible de los residuos de Cys en las proteínas es un mecanismo destacado de la señalización redox2,4. Los productos reversibles incluyen disulfuros, ácidos sulfénicos, S-nitrosotiol y especies de persulfuros2,4,85,86,87. Estas modificaciones pueden ser revertidas por los sistemas GSH/glutaredoxina o tiorredoxina87. Un enfoque común en la detección del grupo de residuos de Cys modificados reversiblemente es bloquear primero los tioles reducidos con un reactivo reactivo y luego reducir y derivatizar los residuos previamente oxidados con una etiqueta que puede identificarse mediante LC-MS de digestiones trípticas88. Estos enfoques se pueden extender al uso de la química específica de modificación para etiquetar solo un producto de oxidación particular, como un S-nitrosotiol, ácido sulfénico o persulfuro88. Hasta hace poco, las principales limitaciones de estos enfoques eran la baja cobertura del grupo total de Cys y la falta de cuantificación de la modificación en residuos individuales87,88,89. Este último es de particular importancia cuando se interpreta la importancia biológica de las modificaciones reversibles. Se han logrado mejoras sustanciales en la cuantificación mediante el etiquetado isobárico, en el que los residuos de Cys reducidos se etiquetan primero con una etiqueta, los residuos modificados reversiblemente se reducen y luego se etiquetan con una etiqueta químicamente idéntica, pero modificada con isótopos pesados, que permite la cuantificación de la proporción. oxidado para cada Cys particular. Estos métodos se han extendido a etiquetas que incorporan restos como la biotina, que permiten el enriquecimiento de los péptidos marcados, lo que mejora en gran medida la cobertura de Cys. La iteración más reciente de este enfoque, como lo demuestra el estudio OxiMOUSe89, ha reemplazado a los métodos anteriores.

La metionina es también un sitio importante de modificaciones redox postraduccionales. La oxidación a sulfóxido de metionina se puede revertir enzimáticamente mediante las enzimas reductasas de sulfóxido de metionina, lo que podría facilitar la señalización redox mediante la instalación/eliminación de un solo átomo de oxígeno17. Se han desarrollado reactivos para la bioconjugación de metionina que pueden identificar y caracterizar sitios de metionina sensibles a redox en proteomas90.

Recomendación 13: ELISA, FTC y la inmunotransferencia son herramientas útiles en la detección de carbonilos de proteínas como biomarcador del daño oxidativo general de proteínas, aunque debe tenerse en cuenta que no todos los productos de oxidación de proteínas contienen carbonilos. Los enfoques de LC-MS, que utilizan muestras cuidadosamente preparadas, son las mejores técnicas disponibles para evaluar la oxidación de proteínas debido a la sensibilidad, selectividad y cuantificación disponibles con estos métodos. También se recomienda el uso de enfoques ortogonales, como anticuerpos específicos y validados (ver más abajo) contra productos de oxidación individuales.

Las modificaciones oxidativas del ADN y el ARN se utilizan a menudo como biomarcadores del daño oxidativo1,13,91. Un método utilizado para evaluar el daño oxidativo 'general' en el ADN de las células es el ensayo cometa, que detecta roturas de cadenas de ADN. Tales rupturas pueden surgir por varios mecanismos, no necesariamente a través del daño oxidativo, pero el uso de enzimas reparadoras que "cortan" el ADN en los sitios de oxidación aumenta la especificidad para el daño oxidativo del ADN. La medida más sencilla es la longitud del ADN 'fantasma' después de la electroforesis de células incrustadas en un gel en un portaobjetos de microscopio92.

El daño oxidativo al ADN generalmente se enfoca en la oxidación de guanina a 8-oxo-7,8-dihidro-2′-desoxiguanosina (8OHdG u 8-oxodG). Los datos sobre modificaciones en otras bases son limitados, aunque es probable que sean biológicamente importantes1,13. Estas mediciones requieren el aislamiento del ADN y su digestión para liberar bases modificadas, y puede haber oxidación espuria durante el manejo y análisis de la muestra. Iniciativas multilaboratorio93 han establecido protocolos para evitarlo y han determinado niveles 'normales' de 8OHdG. La cantidad de 8OHdG (o cualquier otro producto del daño oxidativo del ADN) medida en el ADN es el equilibrio entre la tasa de oxidación y la de reparación. La mejor metodología es LC-MS/MS de ultra rendimiento (UPLC-MS/MS)94. Se debe tener precaución al usar métodos ELISA, que carecen de sensibilidad y especificidad y pueden dar resultados variables entre lotes, y a veces hay una reacción cruzada entre la 8-hidroxiguanosina (8OHG) y la 8OHdG. Sin embargo, la inmunohistoquímica puede ser útil en la identificación de células que tienen cantidades más altas de 8-OHdG in vivo, si se aplica adecuadamente95.

Los nucleósidos oxidados tanto del ADN como del ARN se pueden detectar en varios fluidos corporales. Originalmente se creía que surgían de la reparación del ADN, en particular de la reparación por escisión de nucleótidos. Sin embargo, también surgen de la oxidación de las reservas de precursores de nucleótidos de ADN y ARN 'desinfectados' mediante la eliminación de productos oxidados94. Las contribuciones relativas de la reparación del ADN y la desinfección de la reserva de nucleótidos a los niveles de nucleósidos oxidados detectados en los fluidos corporales no están claras actualmente. La orina recolectada durante 24 h representará el número de guaninas en el ADN/ARN y/o los respectivos conjuntos de precursores de nucleótidos oxidados durante ese período96. El muestreo de orina representa la formación dentro de todo el cuerpo y se adapta mejor a situaciones en las que se supone que todos los tejidos están afectados, pero podría ser inadecuado en la detección de cambios que ocurren solo en ciertos órganos. La medición en tejidos específicos será una instantánea del equilibrio entre la generación y la reparación, y es posible que no represente procesos en otros órganos.

Recomendación 14: al medir las modificaciones oxidativas de los ácidos nucleicos de células extraídas o muestras de tejido, se debe tener mucho cuidado para evitar la oxidación espuria en los pasos preparativos y analíticos. Actualmente, los mejores métodos disponibles son métodos como el ensayo cometa (que utiliza enzimas reparadoras del ADN) en células aisladas y UPLC-MS/MS para la determinación de 8OHdG y 8OHG en fluidos corporales o ácidos nucleicos extraídos de tejidos. Los métodos basados ​​en ELISA, especialmente en forma de kit, no suelen estar suficientemente validados y no se recomienda su uso.

Como se discutió anteriormente, los anticuerpos se han utilizado ampliamente para detectar productos de oxidación (y también aductos) formados en proteínas (por ejemplo, carbonilos y 3-nitro- y 3-clorotirosina), ADN (por ejemplo, 8-oxodG) y lípidos (F2 -Isoprostanos). Se han utilizado, por ejemplo, en ELISA, inmunohistoquímica y formatos de inmunoprecipitación, pero a menudo sufren de reactividad de fondo, reactividad cruzada y falta de especificidad. Para abordar esto, se debe documentar el epítopo utilizado para generar el anticuerpo (por ejemplo, como para HNE)62,63,64 y se deben incluir controles para eliminar el fondo. Se recomienda el bloqueo con muestras auténticas del epítopo para determinar la selectividad. La cuantificación relativa es posible, pero la cuantificación absoluta puede ser difícil, por ejemplo, debido a la mala accesibilidad de los epítopos (por ejemplo, en las proteínas, el producto de oxidación puede estar enterrado). Además, los anticuerpos se generan típicamente contra péptidos modificados químicamente y no estructurados, y es posible que no siempre se hayan determinado los epítopos reconocidos.

Recomendación 15: los anticuerpos bien validados contra productos específicos son herramientas de detección útiles cuando se usan con el cuidado y los controles apropiados, incluidos aquellos para interacciones no específicas. Los datos de la competencia con epítopos auténticos deben incluirse siempre que sea posible.

La medición de ROS in vivo es un desafío. Los métodos EPR se han desarrollado pero aún no se utilizan ampliamente. Los enfoques bioluminiscentes para la detección de ROS incluyen luciferina-1 enjaulada con peroxi que, tras la oxidación, forma luciferina in situ que se oxida en sistemas transfectados con luciferasa para generar bioluminiscencia97. Como se señaló anteriormente, los biosensores redox codificados genéticamente se han utilizado en estudios con animales. Con el desarrollo de modalidades mejoradas de sensibilidad y detección, la tomografía por emisión de positrones ahora se usa para obtener imágenes de ROS in vivo98, pero aún está en pañales. En las mitocondrias de las células y los tejidos, los cambios en el H2O2 pueden evaluarse utilizando el boronato MitoB dirigido a las mitocondrias, que se acumula en estos orgánulos y el H2O2 lo convierte en MitoP. La proporción de MitoP a MitoB puede determinarse luego por MS99.

Debido a que el daño oxidativo juega un papel central en muchas patologías humanas, existe un gran interés en desarrollar intervenciones terapéuticas para disminuir este daño1,2,3. Un corolario es que en los ensayos clínicos deberíamos poder demostrar cómo estas intervenciones afectan el daño oxidativo. Por ejemplo, se han realizado muchos ensayos clínicos aleatorios doble ciego utilizando "antioxidantes" como el betacaroteno, la vitamina C y la vitamina E. Por lo general, estos no lograron influir en la actividad de la enfermedad. Desafortunadamente, en la mayoría de los casos no se midió el efecto de la intervención sobre el daño oxidativo, lo que hace que no esté claro si la supuesta terapia fue realmente efectiva para disminuir el daño oxidativo: si no lo fue, la falta de efecto es predecible1,55.

Para abordar esto, es esencial evaluar el impacto de estas intervenciones en los niveles de daño oxidativo en los pacientes en ensayos clínicos. Actualmente, los métodos se limitan a medir puntos finales de daño oxidativo en biopsias (por ejemplo, piel o músculo) o fluidos corporales clínicamente accesibles como plasma, saliva, esputo u orina y, a veces, líquido cefalorraquídeo. Estos biomarcadores han incluido los de oxidación de ácidos nucleicos como 8OHG y 8OHdG100 y F2-isoprostanes como biomarcador de peroxidación lipídica69,101. Hasta la fecha, se ha hecho un uso limitado de biomarcadores de oxidación de proteínas en ensayos clínicos. Sin embargo, existe evidencia de fuertes asociaciones de alteraciones en las proporciones de proteína tiol/disulfuro y aumento de carbonilos de proteína y otras modificaciones con patologías75,76,77.

En términos más generales, los ensayos clínicos deberían incluir biomarcadores validados internacionalmente: idealmente, el biomarcador debería haber sido objeto de una comparación entre laboratorios. Muchos biomarcadores se basan en la medición de la concentración en fluidos corporales como el plasma, pero estos solo reflejan el equilibrio entre las tasas de formación y eliminación y, por lo tanto, no pueden interpretarse fácilmente como "estrés oxidativo". Sin embargo, se han desarrollado modelos para estimar la producción en 24 h de determinados biomarcadores100. Idealmente se debería utilizar un panel de biomarcadores54,55 ya que los productos finales del daño oxidativo a lípidos, proteínas y ácidos nucleicos no necesariamente se correlacionan entre sí, ni esperaríamos que lo hicieran ya que son dianas moleculares diferentes de diferentes ROS.

Recomendación 16: si interviene con antioxidantes, primero use biomarcadores en estudios preliminares de rango de dosis para determinar si la intervención realmente reduce el daño oxidativo a las biomoléculas relevantes. Deben incluir biomarcadores bien definidos analizados con una metodología validada y/o enfoques ortogonales. No recomendamos en estudios clínicos (¡u otros!) el uso del ensayo d-ROMS (por las razones explicadas en la referencia 1), TBARS, determinaciones de la actividad antioxidante total1,102 o métodos basados ​​en kits donde la metodología detrás del kit no está claro y/o no ha sido validado.

El objetivo de esta declaración de consenso es generar un recurso útil para investigadores de diversos campos que necesitan medir ROS y evaluar eventos oxidativos para investigar su importancia biológica. Hemos discutido las limitaciones de muchos de los procedimientos utilizados actualmente y sugerido los mejores enfoques disponibles actualmente. Inevitablemente, se desarrollarán y aplicarán nuevas técnicas en el futuro, pero los principios de nuestra cautelosa filosofía, ilustrados por nuestras 16 recomendaciones (resumidas en la Fig. 1), seguirán siendo válidos.

Aquí hemos resumido y abreviado las recomendaciones de mejores prácticas desarrolladas en este manuscrito.

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Pedimos disculpas a nuestros colegas por la gran cantidad de documentos clave que no pudimos citar debido a limitaciones de espacio, combinados con la amplitud de cobertura requerida en una Declaración de Consenso. Agradecemos a AJ Kowaltowski por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. El trabajo en el laboratorio de MPM cuenta con el apoyo de una subvención del Medical Research Council UK (n.º MC_UU_00015/3) y de un premio Wellcome Trust Investigator (n.º 220257/Z/20/Z). El trabajo en los laboratorios de HB y VEK cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH), EE. UU. (concesión n.º AI145406, CA165065, CA266342, HL114453, AI156924, NS076511, AI156923, NS061817 y NS117000). KJAD fue apoyado por la subvención no. ES003598 del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los NIH de EE. UU., y por concesión no. AG052374 del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los NIH de EE. UU. RR fue apoyado por becas de la Universidad de la República, Uruguay (núms. CSIC_2018 y EI_2020). La investigación en el laboratorio de BH cuenta con el apoyo de subvenciones del Consejo Nacional de Investigación Médica de Singapur, la Universidad Nacional de Singapur, la Fundación Nacional de Investigación de Singapur y la Fundación Tan Chin Tuan. CJC cuenta con el apoyo de NIH (núms. GM 79465, GM 139245 y ES 28096) y es becaria de CIFAR. El trabajo en el laboratorio de ST cuenta con el apoyo de JST CREST (subvención n.° JPMJCR19H4), JSPS Kakenhi (subvención n.° JP16H06276[AdAMS], JP19H05462 y JP20H05502) y una Beca de investigación del Princess Takamatsu Cancer Research Fund (n.° 19-25126). ). El trabajo en el laboratorio de TPD está respaldado por subvenciones del Consejo Alemán de Investigación (núms. DFG, TRR184 y SPP2306) y el Consejo Europeo de Investigación (núm. 742039). El trabajo en el laboratorio de HY cuenta con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (núms. 32030053 y 32150710522). El trabajo en el laboratorio de MJD cuenta con el apoyo de la Fundación Novo Nordisk (nº de subvención NNF13OC0004294, NNF19OC0058493 y NNF20SA0064214). El trabajo en el laboratorio de N.-GL cuenta con el apoyo del Consejo Sueco de Investigación (2015-00418), la Fundación Sueca del Cáncer, la fundación Knut y Alice Wallenberg, el Consejo Europeo de Investigación (Advanced Grant 2016-741366) y la Fundación Novo Nordisk. BH agradece a Alvin Loo por plantear el tema de los kits dudosos para medir ROS.

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barry halliwell

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El ímpetu inicial para esta declaración de consenso provino de BH y MPM, quienes escribieron las versiones inicial y final. HB, VB, CJC, KJAD, MJD, TPD, TF, HJF, YJ-H., DG, VEK, BK, N.-GL, GLM, TN, HEP, RR, HVR, PTS, PJT, ST, CCW y HY escribió partes del manuscrito y editó y aprobó todo el manuscrito.

Correspondencia a Michael P. Murphy o Barry Halliwell.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Metabolism agradece a Liron Bar-Peled, Kathy Griendling y Pietro Ghezzi por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Christoph Schmitt, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Reimpresiones y permisos

Murphy, MP, Bayir, H., Belousov, V. et al. Directrices para medir especies reactivas de oxígeno y daño oxidativo en células e in vivo. Nat Metab 4, 651–662 (2022). https://doi.org/10.1038/s42255-022-00591-z

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Recibido: 14 enero 2022

Aceptado: 19 de mayo de 2022

Publicado: 27 junio 2022

Fecha de emisión: junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00591-z

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