Análisis estructural de un endógeno 4 - Pekín resina epoxi Co., Ltd.

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 552 (2023) Citar este artículo

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El complejo de oxoglutarato deshidrogenasa (OGDHc) participa en el ciclo del ácido tricarboxílico y, en una reacción de varios pasos, descarboxila el α-cetoglutarato, transfiere el succinilo a CoA y reduce el NAD+. Debido a su papel fundamental en el metabolismo, los componentes enzimáticos de OGDHc se han estudiado de forma aislada; sin embargo, sus interacciones dentro de la OGDHc endógena siguen siendo esquivas. Aquí, discernimos la organización de una OGDHc nativa termófila, eucariótica en su estado activo. Al combinar métodos bioquímicos, biofísicos y bioinformáticos, resolvemos su composición, arquitectura 3D y función molecular a una resolución de 3,35 Å. Además, informamos sobre la estructura crio-EM de alta resolución del núcleo OGDHc (E2o), que muestra varias adaptaciones estructurales. Estos incluyen patrones de enlaces de hidrógeno que limitan las interacciones de las enzimas participantes de OGDHc (E1o-E2o-E3), túneles electrostáticos que impulsan la comunicación entre subunidades y la presencia de una subunidad flexible (E3BPo), que conecta E2o y E3. Este análisis multiescala de un extracto de células nativas productoras de succinil-CoA proporciona un modelo para estudios de estructura y función de mezclas complejas de valor médico y biotecnológico.

El complejo de oxoglutarato deshidrogenasa (OGDHc) es uno de los principales reguladores del flujo metabólico en el ciclo tricarboxílico (TCA), lo que significa que las células mantienen la abundancia y actividad de OGDHc bajo estricto control1,2. En eucariotas, la OGDHc está activa en la mitocondria, pero una fracción del complejo también se localiza en el núcleo realizando la succinilación de lisina de las histonas3. La reacción catalizada por OGDHc, la descarboxilación de oxoglutarato (α-cetoglutarato) a succinil-CoA, es importante para la producción de energía, la interacción metabólica entre las mitocondrias y el citoplasma, así como el metabolismo de los neurotransmisores. Esto se debe a que el oxoglutarato (α-cetoglutarato) se genera en el ciclo TCA durante la oxidación de carbohidratos y ácidos grasos y por la glutamato deshidrogenasa durante la desaminación oxidativa del glutamato. También se produce por transaminación de glutamato como parte de la lanzadera de malato-aspartato, que transfiere equivalentes reductores del citoplasma a las mitocondrias. Esta posición crucial de la OGDHc en el metabolismo y la asociación entre la disminución de la actividad de la OGDHc en el cerebro y la neurodegeneración ha estimulado una extensa investigación4,5. Además, la OGDHc es muy sensible a las especies reactivas de oxígeno (ROS)6, y su posible inhibición debido al estrés oxidativo podría resultar perjudicial para el metabolismo global de una célula. Tales condiciones celulares asociadas con el cáncer pueden afectar la actividad de OGDHc7, especialmente considerando que el oxoglutarato es un efector de la supresión tumoral mediada por p538. En consecuencia, la comprensión de las relaciones estructura-función de OGDHc es de particular interés.

A nivel molecular, la OGDHc es un ensamblaje del tamaño de un megadalton de múltiples copias de tres enzimas, a saber, E1o (oxoglutarato deshidrogenasa, EC 1.2.4.2), E2o (dihidrolipoil succiniltransferasa, EC 2.3.1.61) y E3 (dihidrolipoil deshidrogenasa, EC 1.8. 1.4). E2o forma el núcleo del complejo con una estequiometría estable de 24 copias en un ensamblaje cúbico, mientras que las proteínas E1o y E3 se ensamblan en su periferia para llevar a cabo la reacción completa en un metabolón de alto orden todavía estequiométrica y estructuralmente desconocido (Fig. 1A ). Aunque los componentes enzimáticos únicos de OGDHc se han resuelto estructuralmente y se ha estudiado la caracterización cinética de sus pasos discretos9,10,11 (Fig. 1B), se desconoce su intercomunicación, lo que dificulta, por lo tanto, los estudios de estructura-función subyacentes a este metabolón. Debido al desafío de probar su estructura y función endógenas, recientemente se empleó el análisis de espectrometría de masas moderno combinado con el modelado basado en reticulación para obtener información sobre la proximidad de la subunidad de OGDHc a baja resolución sin probar su actividad12. Esto se debe al hecho de que el metabolón aún no se ha reconstituido in vitro como una entidad funcional a pesar de décadas de investigación. Además, el dominio lipoilo (LD) que transfiere intermediarios lipoilo de un sitio activo al siguiente (E1o → E2o → E3) es parte de un brazo E2o altamente flexible, lo que representa un desafío particular para su estudio por métodos estructurales tradicionales. La participación potencial de elementos estructurales adicionales, como subunidades que podrían contribuir a la comunicación cruzada de OGDHc, es decir, KGD413, complica aún más la caracterización del complejo.

Una representación esquemática del conocimiento previo sobre la arquitectura general de OGDHc. Un núcleo cúbico compuesto por 24 proteínas E2o, con conectores flexibles extendidos que terminan en el dominio LD ordenado y dímeros E1o y E3 en la periferia. B Esquema de reacción completo de OGDHc. C Microscopía de luz fluorescente de filamentos aislados de C. thermophilum, con la membrana celular de color rojo, teñidos con FM464. D Microscopía de luz fluorescente de un solo filamento de C. thermophilum, con la membrana celular en color rojo, teñido con FM464. E Microscopía de luz fluorescente de un solo filamento de C. thermophilum, con el abundante contenido mitocondrial visible en color verde, teñido con MiOr. F Imagen de microscopía electrónica de transmisión de secciones ultrafinas criofijadas de filamento de C. thermophilum. Con "M" se anotan las mitocondrias en la imagen. G Amplíe las ultraestructuras de las mitocondrias visibles en F. Las christae en forma de cinta de las mitocondrias de C. thermophilum son visibles (anotadas como "RLC").

En este trabajo, nos esforzamos por dilucidar la estructura del metabolón OGDHc en el contexto de una fracción de lisado nativo derivada de Chaetomium thermophilum después de un fraccionamiento de un solo paso de lisado crudo (Fig. 1 complementaria). C. thermophilum es un hongo filamentoso termofílico con una temperatura de crecimiento óptima de 54 °C y la termoestabilidad inherente de sus proteínas y complejos de proteínas lo convierte en un modelo ideal para estudios estructurales centrados en objetivos de múltiples componentes, como OGDHc u otros complejos de proteínas14 ,15,16. Las ventajas inherentes de un extracto de células termófilas se exponen mientras analizamos su composición y arquitectura. Empleamos ensayos bioquímicos para revelar los parámetros cinéticos del complejo para producir succinil-CoA, identificar todos sus componentes y utilizar microscopía crioelectrónica, reticulación e inteligencia artificial (IA) para dilucidar la megaestructura del complejo en alta resolución con una recopilación de datos rigurosa. estrategias. En general, proporcionamos una instantánea de múltiples escalas de un extracto celular enriquecido en OGDHc que está subrayado por regiones flexibles que dictan interacciones enzima-enzima transitorias, grupos de enzimas que canalizan electrostáticamente los intermedios de OGDHc y una arquitectura de orden superior de OGDHc crítica para el complejo general. función.

El hongo termofílico C. thermophilum se cultivó a 54 °C durante 20 h antes de lisar y fraccionar por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) 8 g de peso fresco de células (Métodos). Las hifas de C. thermophilum (Fig. 1C-G) son ricas en mitocondrias, según lo validado por métodos de microscopía confocal y electrónica (Fig. 1C-G). Las mitocondrias exhiben las crestas lamelares en forma de cinta esperadas, formando pilas paralelas en la sección transversal17 (Fig. 1F, G). Una gran abundancia de mitocondrias (Fig. 1F, G) es consistente con el aumento de las tasas respiratorias de los termófilos18 y nos motivó a derivar un extracto celular enriquecido en actividades mitocondriales en el que la OGDHc funcional se presenta en gran abundancia14 con todas sus subunidades conocidas (E1o , E2o, E3)19. Aquí, verificamos la presencia de todas las enzimas a través de Western Blot (WB) (Fig. 2A, Fig. 2A complementaria) y procedimos con la caracterización de parámetros cinéticos cuantitativos para todos los sustratos solubles del metabolón, a saber, NAD +, α-cetoglutarato (α-KG ) y coenzima-A (CoA). OGDHc cataliza la conversión de α-cetoglutarato (α-KG) en succinil-CoA a través de una reacción de múltiples pasos que involucra diferentes cofactores (Fig. 1B): el difosfato de tiamina (ThDP) se une al E1o, un lipoato unido covalentemente al dominio de unión a lipoílo (LD) de E2o, mientras que FAD se une a su sitio respectivo en E3. E1o y E2o son exclusivos de este complejo, pero E3 se comparte entre todos los complejos de oxoácido deshidrogenasa. Los valores de KM en fracción se determinaron en [149,80 ± 41,78] μΜ, [146,11 ± 46,15] μΜ y [22,81 ± 11,93] μΜ respectivamente (Fig. 2B, Fig. 2B complementaria, Datos complementarios 1) y son comparables a los de otros contrapartes termófilas20,21. Para mostrar con precisión la ventaja de un extracto celular activo derivado de un eucariota termófilo, repetimos la caracterización y realizamos una comparación de la velocidad de reacción para α-KG en un gradiente de temperatura entre un extracto equivalente de C. thermophilum y S. cerevisiae (Fig. .2C, Datos Suplementarios 1). Los datos derivados muestran claramente un aumento de la velocidad de reacción para el extracto celular derivado de C. thermophilum en contraste con la disminución de la velocidad de la muestra equivalente de levadura que muestra la idoneidad para el análisis estructural del extracto celular derivado de un organismo termofílico. Hasta donde sabemos, la medición de los parámetros cinéticos para todos los sustratos de OGDHc en una sola muestra endógena no se ha informado previamente. Nuestros resultados establecen un punto de referencia para futuras comparaciones funcionales de complejos de cetoácidos. Nuestros hallazgos también demuestran que una sola fracción celular es cinéticamente activa, escalable debido a su naturaleza bioquímica y explotable para la formación de productos sin necesidad de esquemas adicionales de purificación o enriquecimiento. Es importante destacar que un extracto de células activas de este tipo se puede visualizar mediante crio-EM para profundizar la comprensión estructural del complejo activo.

A Western blot que muestra la detección de todos los componentes de OGDHc en la fracción de extracto de células nativas en el peso molecular esperado (MW). Se usó una fracción de peso molecular bajo como control negativo, mientras que la proteína sobreexpresada que se usó para crear los anticuerpos se empleó como control positivo. Debido al gran tamaño de la proteína E1o, se empleó un fragmento por este motivo (ver Métodos). Las bandas correspondientes se han anotado con una flecha naranja. B Caracterización enzimática de la OGDHc nativa. Se usaron α-cetoglutarato, NAD+ y CoA en las concentraciones que se muestran en cada gráfico en consecuencia, la velocidad se normalizó a 0-1 y una línea conecta cada punto, con diferentes símbolos que anotan los puntos de datos para las tres réplicas biológicas independientes, como se anota. en el panel de figuras. C Gráfico que muestra el cambio en la velocidad de reacción (después de la normalización a 0-1) en relación con la temperatura para C. thermophilum en comparación con una muestra equivalente de levadura, con diferentes símbolos que anotan los puntos de datos para las tres réplicas biológicas independientes, como se indica en la panel de figuras Los valores de KM que se muestran en los gráficos B y C se obtuvieron mediante los gráficos de Burk-Lineweaver que se muestran en la Fig. 2B complementaria y el fondo gris para cada gráfico y las barras negras en el gráfico inferior representan la desviación estándar derivada de N = 3 réplicas biológicas independientes y 2 duplicados técnicos por cada réplica. Todos los valores que se muestran aquí se enumeran en Datos complementarios 1.

Para caracterizar estructuralmente el metabolón OGDHc, realizamos una adquisición intensiva de datos crio-EM del extracto activo caracterizado. La estructura determinada para el núcleo E2o alcanzó una resolución de 3,35 Å (Figura complementaria 3A, Tabla complementaria 1) que permitió la creación de modelos de novo y mejoró considerablemente la resolución con respecto al núcleo E2o informado anteriormente16 (Figura complementaria 3B). El mapa EM (Fig. 3A) muestra características estructurales de orden superior, por ejemplo, interfaces intertriméricas e intratriméricas (Fig. 3B), captura elementos de estructuras secundarias y coloca con precisión las cadenas laterales de aminoácidos (Fig. 3C complementaria). Pudimos identificar el sitio activo catalítico de E2o y modelar completamente las conformaciones de la cadena lateral de los aminoácidos que participan en la unión de CoA que se conservan en las oxoácidos deshidrogenasas. F247 tiene una orientación hacia el exterior para acomodar el CoA (Fig. 3C), interactuando y estabilizando el grupo difosfato de adenosina 3',5'-CoA a través del apilamiento π. La presencia limitada de densidad electrónica para los componentes de ácido pantoico, β-alanina y cisteamina de CoA subyace a la flexibilidad inherente de la coenzima A unida endógenamente con implicaciones para la función22.

A El mapa crio-EM de 3,35 Å (0,143 FSC) del núcleo OGDHc E2o de C. thermophilum. Barra de escala: 5 nm. B El modelo reconstruido del núcleo C. thermophilum E2o, ajustado en el mapa crio-EM. Debajo, las interfaces intertriméricas e intratriméricas se pueden observar de forma aislada. C La región de unión a CoA de E2o, con las cadenas laterales de aminoácidos anotadas que participan en su coordinación. Además, la densidad resuelta en el bolsillo puede corresponder a un CoA unido. D Densidad resuelta en la periferia del trímero de vértice E2o, posiblemente perteneciente a un dominio lipoílo E2o unido.

Se observa otra densidad próxima al sitio de unión del lipoílo E2, y en la que puede encajar el dominio lipoílo (LD) de la región E2o N-ter (Fig. 3D); Esta observación está en línea con los datos publicados anteriormente, donde en el complejo de piruvato deshidrogenasa endógeno bacteriano (PDHc), que también forma un núcleo cúbico, una característica de los complejos de cetoácidos en todos los reinos, también se atribuyó una densidad equivalente al LD23. Una LD unida también se refinó estructuralmente en el sitio activo de PDHc E2 eucariota en una conformación estable similar24. En el OGDHc eucariótico, nativo y activo que se presenta aquí, esta densidad persiste, aunque con una resolución más baja, y el LD se puede acomodar parcialmente (Fig. 3D). Una diferencia importante radica en el hecho de que, en comparación con la PDHc bacteriana, que podría quedar atrapada en un estado de reposo propuesto con todas las LD unidas a los sitios activos de E2, la OGDHc eucariótica presente destaca un estado de reposo alternativo en el que las LD están subestequiométricamente y transitoriamente. interactuando con el núcleo E2. En general, esta estructura central de OGDHc comprende la reconstrucción de mayor resolución reportada hasta la fecha para un miembro de la comunidad de proteínas caracterizado en extractos de células nativas. Además de las características obvias de alta resolución, las interfaces de orden superior y los sitios activos de LD/CoA se definen en alta resolución, mientras que, debido a su naturaleza endógena, aparecen densidades de baja resolución para el CoA unido de forma flexible y el LD unido de forma subestequiométrica. .

La reconstrucción de OGDHc dihidrolipoil succiniltransferasa (E2o) destaca una amplia similitud con la contraparte inactiva y sobreexpresada humana en términos de plegamiento general pero con adaptaciones localizadas (Fig. 4). El E2o N-ter en estructuras previamente publicadas no adquiere un pliegue específico (Fig. 4A). Por el contrario, en C. thermophilum este elemento obtiene una conformación de cadena β (E188-M194) que, junto con un motivo de horquilla β de los residuos N266 - D282, crea una hoja β extendida (Fig. 4B). Esta adaptación contribuye a la estabilización del núcleo a través de extensos enlaces de hidrógeno y afecta la intercomunicación de las subunidades en el estado de orden superior del núcleo E2o cúbico de 24 méricos. Este pliegue impone una condensación del trímero central E2o en comparación con su contraparte humana publicada anteriormente, traducida en una distancia centroide más baja a través de las subunidades (Fig. 4C, Fig. 4A complementaria). La puntuación posterior basada en la energía de las interfaces intertriméricas e intratriméricas humanas10 y C. thermophilum (Figuras complementarias 4B, C, Métodos) muestra puntuaciones consistentemente más altas para las interfaces E2o termófilas nativas. Teniendo en cuenta que el área de superficie enterrada es proporcional a las constantes de disociación (KD) medidas experimentalmente de los complejos biomoleculares que no experimentan grandes cambios conformacionales25, nuestros resultados sugieren una unión más fuerte de las enzimas E2o de C. thermophilum. De acuerdo con esta noción, las interfaces intra e intersubunidades de C. thermophilum son 1.7 y 1.5 veces más grandes que las interfaces correspondientes del núcleo E2o humano (Figuras complementarias 4B, C) e incluyen extensas interacciones de carga-carga (Figuras complementarias 4B, C). 4B,C). Otra consecuencia de la citada compactación es el confinamiento inducido del E2o N-ter LD. Una hoja β antiparalela tiene una mayor estabilidad en comparación con la conformación de bucle previamente resuelta26. Las láminas antiparalelas y mixtas pueden soportar tanto las distorsiones (torceduras y protuberancias β) como la exposición a solventes; por lo tanto, el elemento estructural recién identificado puede servir como punto de anclaje para restringir las conformaciones exploradas por la región flexible que conecta los dos dominios E2o ordenados, es decir, la succiniltransferasa que forma el núcleo E2 y las LD que transportan los intermedios.

Una proteína E2o de C. thermophilum (naranja) alineada con su contraparte humana (cian). Las diferencias notables incluyen una conformación de giro más estrecha que da como resultado una mejor alineación del modelo de horquilla β de C. thermophilum y la conformación de cadena β de C. thermophilum N-ter. B El motivo de horquilla β de N266-D282, junto con la cadena β N-ter E188-M194 forman una lámina β que contribuye a la estabilidad general del núcleo. C Representación esquemática del desplazamiento rotacional del trímero de vértice E2o humano en comparación con el trímero E2o de C. thermophilum resuelto experimentalmente, que muestra una conformación "suelta" para la contraparte mesófila.

Durante la catálisis (Fig. 1B) en el metabolón OGDHc activo que capturamos (Fig. 2B), el brazo E2o flexible que sostiene el LD transporta el intermediario succinilo de los sitios activos E1o a E2o y es reoxidado por el E327; Por lo tanto, la lisina lipoilada de la LD debe tener acceso sin obstáculos a cada sitio enzimático. Para caracterizar estructuralmente estas interfaces transitorias, se realizó el modelado AlphaFold-Multimer28 de las tres interfaces de componentes integrados en metabolones (E1o-LD, E2o-LD y E3-LD). Los modelos generados para los tres complejos (Fig. 5A-D, Métodos) son de alta calidad y sus interfaces predichas se clasifican con confianza dentro del error experimental (Fig. 5A, B complementarias). Además, (a) el ajuste del LD en la densidad proximal del núcleo E2o derivado de cryo-EM (Fig. 3D) es similar al predicho por AI en términos de posicionamiento (Fig. 5B) y (b) la distancia de la lisina lipoilada al cofactor o sitio activo para todas las interfaces generadas está en el rango de 10 a 25 Å (Fig. 6A-D complementaria). Este rango corresponde a la longitud de la cadena lateral de lisina y el lipoato y también refleja la flexibilidad intrínseca de las proteínas que interactúan15, también observada en una interfaz bacteriana reciente de PDHc E2o-LD24. E1o forma un homodímero (Fig. 5A), con dos difosfatos de tiamina (ThDP) y, potencialmente, dos sitios de unión a LD localizados en la interfaz entre cadenas de E1o (Fig. 5A). La distancia de la lisina lipoilada al átomo ThDP C2 que se succinila durante la descarboxilación del α-cetoglutarato es bioquímicamente factible (d = 14 Å) (Fig. 6A complementaria). E2o se une a un solo LD por monómero (Fig. 5B), y la lipoil-lisina está próxima a la CoA unida, con una distancia de grupo tiol de lisina Cα-CoA de d = 10 Å también (Fig. 6B complementaria). Por último, el sitio activo de E3 ubica un puente disulfuro conservado y una histidina en la proximidad involucrada en la reacción de reoxidación de LD mediada por E329,30,31. El complejo E3-LD basado en AI muestra que la lisina lipoilada está a una distancia razonable para acceder a los enlaces disulfuro en el sitio activo E3 (d = 23 Å) (Fig. 6D complementaria). Tenga en cuenta que se generó un segundo modelo de conformación alternativo para los complejos E1o-LD y E3-LD (Figura complementaria 5B, Figura complementaria 6C, D) pero no cumplió con las restricciones bioquímicas mencionadas anteriormente esenciales para un metabolón activo (Figura .2B).

Un modelo derivado de IA de la interacción E1o-LD. El modelo general, la energía (interacciones VdW Van der Waals, energía de desolvatación DS, electrostática ES) y el área de superficie enterrada (BSA), y la carga general de su interfaz de interacción con el LD se pueden ver a la izquierda, en el medio y a la derecha, respectivamente. B Modelo derivado de IA de la interacción E2o-LD. El modelo general, la energía y el área de superficie enterrada, y la carga general de su interfaz de interacción con el LD se pueden ver a la izquierda, en el medio y a la derecha, respectivamente. C Modelo derivado de IA de la interacción E3-LD. El modelo general, la energía y el área de superficie enterrada, y la carga general de su interfaz de interacción con el LD se pueden ver a la izquierda, en el medio y a la derecha, respectivamente. D Modelo derivado de IA del dominio LD ordenado de E2o. Lys42 lleva el resto lipoílo. Se observa una interfaz de interacción altamente cargada negativamente. Los valores originales para el trazado se pueden encontrar en Datos complementarios 5.

Las interfaces integradas en metabolones generadas por IA y validadas bioquímicamente (E1o-LD, E2o-LD y E3-LD) y crio-EM (E2o-LD) comparten una característica común, revelada después de someter cada una a un refinamiento basado en la energía (Fig. .5A–C): Todas las interfaces se rigen por fuertes interacciones electrostáticas de magnitud comparable (Fig. 5A–C) que comprenden un componente energético característico para interfaces transitorias con altas tasas de encendido/apagado32. La electrostática complementaria (Fig. 5D) es una característica colectiva en los metabolones que transportan productos intermedios a través de un mecanismo de "brazo oscilante"33 y otros procesos metabólicos que requieren un rápido encendido/apagado34,35. De hecho, los mapas de potencial electrostático resaltan extensas regiones cargadas positivamente para los aglutinantes LD (Fig. 5D). Estas superficies atraen y acomodan la superficie cargada negativamente del LD y, en general, contribuyen a la compactación estructural de los complejos de oxoácido deshidrogenasa36, que es un principio clave para lograr la canalización metabólica a través del mecanismo de "brazo oscilante"37.

Para dilucidar el proteoma más amplio y sus interacciones dentro del extracto activo, realizamos experimentos de entrecruzamiento basados en espectrometría de masas directamente en el extracto (Métodos) mientras comparamos las concentraciones de entrecruzamiento (Figuras complementarias 7A, B). En general, con un FDR del 2 % en el nivel de recuperación de péptidos (Métodos), recuperamos 4949 entrecruzamientos de residuos (3632 intra y 1317 entre entre residuos), de los cuales el 99,4 % se asignó a cadenas polipeptídicas de C. thermophilum (datos complementarios). 2). De un total de 2091 cadenas polipeptídicas, 505 cadenas polipeptídicas se entrecruzaron en 2 réplicas biológicas y 2 técnicas (Datos complementarios 2). Esto muestra que el 29,1% del proteoma total de C. thermophilum se organiza en comunidades celulares38 que son significativamente más grandes que las descritas previamente19.

El análisis de red identificó 54 comunidades celulares de diversos compartimentos celulares (Datos complementarios 2) en las que participan 1488 miembros identificados. La cobertura de subunidades en las comunidades es alta (67 % +/−24 %) e incluye ejemplos como el aparato de traducción citoplasmático completo (N = 128, 96 % de las subunidades) y mitocondrial (N = 74, 99 % de las subunidades). Además, identificamos todas las subunidades de la comunidad del ciclo del ácido tricarboxílico/piruvato deshidrogenasa entrecruzadas (PDHc/TCA, N = 25, 100 % de las subunidades, Datos complementarios 2). Dentro de la comunidad de PDHc/TCA, los enlaces cruzados definen interacciones dentro y entre once enzimas participantes (122 intra- y 169 inter-enlaces, Datos Suplementarios 2). La proteína E3 mostró la mayor cantidad de entrecruzamientos identificados en el experimento (N = 88) y se encontró cerca de otros siete miembros de la comunidad (Fig. 6A), lo que indica su papel diverso en el metabolismo mitocondrial; Las proteínas E3 exploran posiciones espaciales proximales con todas las subunidades de PDHc (E1p, E2p, E3BP), OGDHc (E1o, E2o) y una subunidad del hipotético metabolón del hemo mitocondrial39, interactuando dentro de este último con una supuesta holocitocromo c sintasa (HCC) ( Figura 6A). Sin embargo, el análisis de la secuencia resaltó una proteína ribosomal fusionada y mal anotada en el HCC N-ter (Fig. 8 complementaria) que corresponde a la elusiva subunidad eucariota KGD4 OGHDc12,13 que une el E3 al núcleo OGDHc E2 (residuos M1 - T130). Este N-ter comparte una gran similitud con KGD4 de otros eucariotas (Fig. 8 complementaria). El nuevo análisis de los datos de MS19 a través de fracciones celulares muestra una fuerte coelución de KGD4 con el resto de las subunidades OGDHc en las tres réplicas biológicas (Datos complementarios 2). Debido a que su función es esencialmente la misma que la PDHc E3BP (uniendo E3 al núcleo E2), designamos a la proteína coeluyente como la proteína E3BPo de C. thermophilum.

A Los entrecruzamientos de E3 revelan una plétora de compañeros de interacción. B Los componentes de la proteína OGDHc están altamente interconectados. Las líneas azules representan los enlaces cruzados entre proteínas y las violetas los enlaces cruzados intraproteicos.

Se identificaron 44 entrecruzamientos únicos intermoleculares y 81 intramoleculares en los componentes OGDHc (E1o, E2o, E3, E3BPo) (Fig. 6B); los enlaces cruzados intramoleculares corroboran aún más los modelos moleculares E1o, E2o y E3 (Fig. 9A complementaria). En detalle, el 92,3 %, 90 % y 100 % de los enlaces cruzados mapeados se satisfacen para E1o, E2o y E3, respectivamente. La distribución de distancias de entrecruzamiento (Fig. 9A complementaria, Datos complementarios 2) recapitula aún más la distribución de distancia logarítmica normal esperada40 y corrobora la calidad de los modelos derivados de IA validados bioquímica y estructuralmente. Los enlaces cruzados intermoleculares en general definen un estado relativamente compacto de la OGDHc porque las enzimas que no se sabe que forman interfaces físicas (E1o/E3; E3BPo/E1o) todavía están presentes en una proximidad relativa (Fig. 6B). La proximidad relativa de E1o y E3 al núcleo de E2o apunta a la participación de la región flexible N-ter de E2 que se localiza aguas abajo del LD en la secuencia primaria (Fig. 6B). Este resultado nos llevó a utilizar el acoplamiento molecular flexible impulsado por reticulación de los modelos de interacción previamente validados del LD con el E1o y el E3 para dilucidar las superficies de interacción muestreadas por el LD (Fig. 7A-C).

A Gráficas de frecuencia de residuos involucrados en la interfaz de unión entre LD y E1o (superior) y LD y E3 (inferior). B Las frecuencias de residuos de cada residuo involucrado en la interacción entre el LD (rosa) y el E1o (gris) revelan una interfaz "guía" (azul) entre los dos que orienta el LD hacia su bolsillo de unión (púrpura). C Las frecuencias de residuos de cada residuo involucrado en la interacción entre el LD (rosa) y el E3 (gris) revelan una interfaz "guía" (azul) entre los dos que orienta el LD hacia su bolsillo de unión (púrpura). Los valores originales para el trazado se pueden encontrar en Datos complementarios 6.

Calculamos la frecuencia de los residuos E1o o E3 involucrados en la unión de LD a partir de los resultados del acoplamiento (Fig. 7A) después de adaptar nuestros protocolos de acoplamiento para incorporar el mapeo de enlaces cruzados en regiones desordenadas próximas a dominios ordenados en interacciones proteína-proteína (Métodos, 25). El mapeo del 25% superior de los residuos involucrados en la unión de LD derivados de 400 modelos moleculares refinados con solventes explícitos ilustra una superficie de atracción distinta para que el LD finalmente se una a los sitios activos respectivos (Fig. 7B, C). Los residuos del sitio activo se identifican como frecuentemente contactados tanto para E1o (Fig. 7B) como para E3 (Fig. 7C), pero la superficie de atracción para E1o es más difusa en términos de puntos calientes recuperados en comparación con la calculada para E3 (Fig. 7B, C). Esta mayor difusión de la señal para la unión de LD en el E1o sugiere que la superficie proximal puede guiar el LD hacia el bolsillo de unión de E1o, ya que está bastante enterrado (Fig. 7B). Para el E3, en cambio, la "superficie de guía" está mucho más confinada (Fig. 7C) en un espacio estrecho que se extiende equiláteramente ~ 5 Å desde el sitio activo plano del E3. Estos resultados apuntan a distintos mecanismos de atracción de LD para las subunidades E1o y E3 periféricas gobernadas por regiones flexibles ubicadas aguas abajo de la LD.

Los enlaces intracruzados identificados no solo validan la presencia de las proteínas participantes y sus estructuras derivadas de IA (Fig. 9A complementaria), sino que también confirman que forman estructuras multiméricas; no se identificaron entrecruzamientos para E3BPo (Fig. 6B), y esto puede ser una indicación de que E3BPo participa en la formación del complejo como monómero; por copia de E3BPo, un solo E3 está conectado a través de su región N-ter flexible al núcleo E213. La traducción de las puntuaciones de iBAQ en datos estequiométricos cualitativos como se hizo anteriormente para PDHc14 apunta a una estequiometría exacta de 24 subunidades E2o, validada por crio-EM; y estequiometrías relativas de <10 dímeros E1o y ~ 4 E3BPo, uniendo 4 dímeros E3 en total (Fig. 9B, C complementarias). Debido a que E3 también está cerca de las regiones desordenadas de E2o y su dominio LD de E2o proximal, es muy posible que se puedan acomodar más E3. Sin embargo, considerando que el núcleo E2 puede reclutar hasta 48 moléculas, totalizando un metabolón de 96 cadenas polipeptídicas (24 monómeros E2o y un máximo de 24 E3BPo, cada uno con 12 dímeros E1o y 12 E3, respectivamente), las estequiometrías relativas revelan una composición subestequiométrica de la periferia. subunidades OGDHc. Esto apunta a la presencia de regiones centrales N-ter E2o flexibles no unidas involucradas en el tráfico de LD.

Para dilucidar la arquitectura de orden superior de la OGDHc dentro del extracto, realizamos reconstrucciones asimétricas a partir de los datos de una sola partícula, lo que condujo a proyecciones 2D donde las densidades externas eran visibles (Fig. 8A). En estas densidades externas, los dímeros E1o y E3 identificados deben ubicarse, cada uno conectado a través de las regiones flexibles del N-ter del E2o (Fig. 6B) o, en el caso de E3, el E3BPo flexible (Fig. 6B) ,13). El mapa crio-EM (Fig. 8B) se determinó con una resolución de 21 Å (Fig. 3B complementaria, Tabla complementaria 1), mostrando densidades alrededor del núcleo E2o, en forma agrupada y no difusa (Fig. 8B). Los umbrales de densidad crecientes del mapa crio-EM mostraron densidades adicionales más débiles (Fig. 8B). El ajuste sistemático de los modelos E1o-LD y E3-LD derivados de AlphaFold2 de C. thermophilum (Fig. 8B, Fig. 10A, B complementaria, Datos complementarios 3) en el mapa crio-EM resolvió la localización de esas moléculas y sugiere que están presentes en la periferia y no sobre o dentro de las densidades centrales. Además, se calcularon soluciones de acoplamiento persistentes que recapitularon las posiciones de E1o y E3 en el mapa a partir de modelos estructurales ajustados sistemáticamente asociados con valores altos de correlación cruzada (Datos complementarios 3, Figura complementaria 10A, B): En general, 2 E1o y 3 dímeros E3 podrían resolverse dentro de las densidades externas calculadas.

Los promedios de clase 2D del OGDHc presentan un núcleo de señal alta, rodeado por una señal más difusa pero aún bien definida en la periferia. Barra de escala: 5 nm. B La reconstrucción 3D asimétrica del OGDHc muestra una fuerte densidad correspondiente al núcleo E2o y una combinación de densidades externas más débiles y más fuertes. En las densidades más fuertes, los dímeros E1o y E3 pueden localizarse con gran confianza. Barra de escala: 10 nm.

Mientras que las enzimas E1o y E3 unidas se distribuyen asimétricamente en las proximidades del núcleo E2o, conservan distancias aproximadamente iguales del propio núcleo (Fig. 8B). La flexibilidad inherente de la región de unión en OGDHc no se concilia con los cálculos físico-químicos o estadísticos para regiones de proteínas flexibles de varias categorías (p. ej., IDP, glóbulo fundido, completamente extendido; Fig. 10C complementaria). De acuerdo con la longitud del enlazador E2o medida en nuestra reconstrucción 3D derivada (Fig. 9A, Fig. 10C complementaria), las regiones flexibles de OGDHc tienen propiedades entre las longitudes calculadas de los IDP "estirados" (IDP tal como se definen en Marsh y Forman-Kay41) y enlazadores "restringidos" (según lo definido por George y Heringa42). Para dilucidar si las distancias medidas entre las enzimas participantes de OGDHc ordenadas que están mediadas por regiones flexibles se pueden recapitular en los datos estructurales disponibles, calculamos la distancia de los residuos de aminoácidos que se resuelven pero que están más separados en cuanto a la secuencia debido a un tramo no resuelto en el datos estructurales. Si bien varias razones técnicas pueden explicar la presencia de este tramo no resuelto, también puede ser un indicador de desorden estructural43. Al analizar todos los datos estructurales del Banco de datos de proteínas (PDB) 44 a partir de junio de 2022 (191 144 estructuras), los resultados muestran distancias dramáticamente confinadas entre los residuos ordenados que preceden y siguen al tramo "faltante" (Fig. 9A). Esto significa que los datos estructurales actuales en el PDB rara vez incluyen interacciones del tipo informado en nuestros resultados (Fig. 8B, Fig. 9A). Es evidente un "aplanamiento" relativo de las distancias calculadas para los tramos de polipéptidos ausentes de más de 25 residuos de aminoácidos (Fig. 9A), y las distancias máximas de Ca-Ca promediaron ~30 Å, que son sustancialmente más cortas que las del metabolón OGDHc .

Un gráfico que representa los valores medios de distancia de los grupos agrupados de todas las secuencias de aminoácidos no resueltas que pertenecen a todas las estructuras de proteínas depositadas en el PDB. Los puntos negros representan el valor medio de una longitud de grupo de aminoácidos, con diferentes escalas de gris la desviación estándar después de la integración de cada cuartil de datos totales, como se indica en la leyenda de la gráfica. La línea roja representa un modelo ajustado que describe la relación entre la distancia y la longitud de los grupos de aminoácidos. Con verde claro, la distancia promedio medida experimentalmente entre el N-ter del dominio central resuelto del E2o y el C-ter del LD que está unido a un dímero E1o ajustado en la periferia, mientras que el verde oscuro representa la misma distancia promedio experimentalmente medido entre el N-ter del dominio central resuelto del E2o y el C-ter del LD que está unido a un dímero E3 ajustado. La línea azul representa la distancia teórica de una secuencia de aminoácidos, mientras que la línea azul discontinua representa el límite inferior teórico de cualquier secuencia de aminoácidos. B Representación esquemática de la organización de subunidades periféricas de la OGDHc resuelta. C Modelo que describe todas las observaciones novedosas relativas a la organización de la OGDHc. La conformación de hoja β N-ter del trímero de vértice del núcleo E2o ayuda a estabilizar y compactar el núcleo E2o de 24 mer, al mismo tiempo que orienta el enlazador flexible que conecta el dominio LD. Los datos de entrecruzamiento revelan una interacción bastante estable entre el enlazador flexible y las subunidades periféricas, lo que posiblemente sugiere un papel estructural de un dominio LD sin carga, mientras que otro dominio LD cargado realiza el ciclo de reacción. La interacción entre el LD y las subunidades periféricas está gobernada por fuertes fuerzas electrostáticas.

Nuestros hallazgos combinados amplían nuestra comprensión de la arquitectura propuesta del complejo de oxoglutarato deshidrogenasa en el contexto de un extracto de células productoras de succinil-CoA (Fig. 9B, C). El núcleo del complejo es una ultraestructura cúbica robusta donde los trímeros E2o que componen los vértices están densamente empaquetados con la ayuda de elementos de estructura secundaria de múltiples subunidades (dominio central N-ter β-sheet). Este empaquetamiento de núcleo denso podría ser una adaptación termófila, como se mostró anteriormente en el caso del complejo piruvato deshidrogenasa relacionado14,15, o una característica general de la OGDHc endógena. Sin embargo, aunque OGDHc se considera similar a PDHc, las conformaciones endógenas de E2 N-ter son distintas: en OGDHc, el E2 N-ter se pliega en una conformación de cadena β, parte de una lámina β entre cadenas; en la PDHc endógena, este elemento N-ter es flexible. Tales adaptaciones estructurales amplían nuestra visión sobre los posibles determinantes de especificidad para la unión de LD claramente cargados a diferentes núcleos E2 en oxoácido deshidrogenasas.

Otra observación que derivamos es que el mismo elemento estructural limita el espacio disponible de los enlazadores flexibles N-ter extendidos que unen el dominio LD, que es el dominio crucial para el transporte de los sustratos a través de los sitios activos secuenciales que toman parte en la reacción, en alrededor de 50 a 100 Å para la interacción LD-E1o y de 60 a 70 Å para la interacción LD-E3. También cabe señalar que la complementariedad electrostática impulsa la unión del LD a sus diversos aglutinantes (E1o, E2o, E3). El enlazador flexible y LD de E2o, según nuestros datos de XL-MS, también pueden actuar como un "ancla" que, en ausencia de dominios de unión a subunidades periféricas específicas en la secuencia E2o N-ter, mantiene las subunidades E1o y E3 en proximidad al núcleo E2o. El dominio N-ter desordenado de E1o se resolvió recientemente para interactuar con el sitio de unión de E1o-LD45 y puede ayudar aún más a organizar E1o en la proximidad del núcleo de E2o al interactuar con otras interfaces de unión de LD en el metabolón. Tanto E1o como E3, que son homodímeros, contienen sitios de unión a LD duales, lo que sugiere que uno desempeña un papel activo en la reacción, mientras que el otro puede mantener una conexión electrostática complementaria altamente cargada con un dominio LD proximal "descargado". Este dominio LD "descargado" puede participar como un "ancla", posiblemente también asistido por otras interacciones más débiles del conector flexible con residuos de superficie de las subunidades periféricas, así como la proteína E3BPo identificada, también capturada en nuestros datos XL-MS para organizar la proteína E3. El papel "estructural" de los dominios LD adicionales también se puede insinuar mediante la relación subestequiométrica entre las subunidades E2o central y E1o-E3-E3BPo periféricas, según lo cuantificado por los datos de MS presentados aquí. La combinación de métodos de biología molecular para sobreexpresar las subunidades E1o, E3, E3BPo y realizar experimentos de mezcla con la fracción de extracto celular que contiene OGDHc permitiría posiblemente obtener una visión más profunda de la interacción de la estequiometría, las interacciones y las adaptaciones de la estructura molecular del metabolón. Este trabajo, con la ayuda de la proteómica cuantitativa con péptidos marcados para determinar con precisión las estequiometrías en el extracto y, por lo tanto, las concentraciones, proporcionaría material importante para comprender la función de OGDHc con crio-EM.

En general, en este trabajo, caracterizamos el contenido completo de un extracto celular con capacidades de producción de succinil-CoA y aclaramos la función bioquímica y las características estructurales novedosas del actor principal de la reacción, la OGDHc y sus componentes, E1o, E2o, E3, E3BPo. . Nuestro trabajo da lugar a preguntas que deben abordarse: ¿Existe una interacción en fracciones entre las múltiples comunidades de proteínas presentes? ¿Cómo se pueden caracterizar sus relaciones bioquímicas y estructurales? Estas preguntas solo pueden responderse mediante el empleo de crio-EM automatizado y de alto rendimiento de un extracto de células reticuladas de alta densidad, combinado con una recopilación de datos a mayor escala para abordar los problemas de flexibilidad compleja y relativa baja abundancia de elementos individuales. . Los avances en instrumentación46, recopilación de datos47 y análisis48,49, así como el advenimiento del modelado preciso impulsado por IA50, permitirán la simplificación de la caracterización de extractos de células nativas. Es posible que en un futuro próximo nuestro enfoque conduzca a nuevos paradigmas de análisis enzimático en el contexto de otros metabolones celulares que siguen siendo esquivos.

Chaetomium thermophilum var. thermophilum La Touche 1950 (Thermochaetoides thermophila51) se adquirió de DSMZ (Leibniz Institute DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Alemania), y las esporas conservadas en ampollas liofilizadas se cultivaron según las instrucciones de la empresa (DSMZ Media list Medium 188 , temperatura: 45 °C). Después del cultivo inicial, el micelio se propagó en medios de cultivo completos líquidos (CCM), que contenían por 1000 ml de ddH2O: 5,00 g de triptona, 1,00 g de peptona, 1,00 g de extracto de levadura, 15,00 g de dextrina, 3,00 g de sacarosa, 0,50 g de MgSO4 × 7 H2O, 0,50 g NaCl, 0,65 g K2HPO4 × 3 H2O y 0,01 g Fe2(SO4)3 × H2O. El pH final de CCM se ajustó a 7,1. Los cultivos finales se realizaron de la siguiente manera: Cultivos en placas de medios sólidos: el CCM líquido se complementó con 15,00 g de Agar/1000 mL ddH2O y luego las placas se inocularon con micelio y se cultivaron a 54 °C. Cultivos en medios líquidos: Se llenaron matraces Erlenmeyer de 2000 ml hasta el 40 % del volumen total (800 ml) con medio CCM líquido, se agregaron pequeños trozos de micelio recién cultivado de placas de agar y luego se incubaron con agitación a 110 rpm y CO2 al 10 % durante 20 H.

Las imágenes de microscopía de fluorescencia se realizaron de la siguiente manera: se utilizó un Zeiss LSM880 (Carl Zeiss, Alemania) con una lente de objetivo de 40X sin inmersión (plan-Apochromat 40X/0,95 NA) para obtener imágenes de las muestras y las imágenes se adquirieron con el software de análisis de imágenes ZEN Black. (Carl Zeiss, Alemania). Para la tinción de membranas con FM 4-64 (ThermoFisher Scientific, EE. UU.), el colorante se diluyó en DMSO hasta una concentración madre de 10 mM; Luego se agregó 1 μL de solución madre a 1 mL de cultivo celular líquido de C. thermophilum, alcanzando una concentración de trabajo de 10 μM. Se tomaron imágenes de las muestras después de 2 a 3 m de tiempo de incubación. Para la tinción de mitocondrias con naranja MitoTracker (ThermoFisher Scientific, EE. UU.), el tinte se diluyó en DMSO a una concentración de stock de 10 μM; Luego se agregaron 5 μL de solución madre a 1 ml de cultivo celular líquido de C. thermophilum, alcanzando una concentración de trabajo de 50 nM. Se tomaron imágenes de las muestras después de 10 min de tiempo de incubación. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) se realizaron de la siguiente manera: los filamentos de C. thermophilum de cultivo líquido recién propagados se fijaron con glutaraldehído al 3% (Sigma, Taufkirchen, Alemania) en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (SCP; pH 7,2) durante cinco horas a temperatura ambiente. temperatura. Después de la fijación, las muestras se enjuagaron en SCP y se posfijaron con tetróxido de osmio al 1 % (Roth, Karlsruhe, Alemania) en SCP durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras se enjuagaron con agua, se deshidrataron en una serie graduada de etanol, se infiltraron con resina epoxi según Spurr (1969)52, se polimerizaron a 70 °C durante 24 h y luego se cortaron en secciones ultrafinas de 70 nm con un ultramicrótomo Ultracut S. (Leica, Alemania). Después del corte, las secciones se aplicaron sobre rejillas de cobre con revestimiento de formvar y se añadió acetato de uranilo y citrato de plomo para la tinción posterior en un dispositivo especializado EM-Stain (Leica, Alemania). Para la obtención de imágenes, se utilizó un TEM Zeiss EM 900 (Carl Zeiss, Alemania) que funciona a 80 keV. Todo el procesamiento de imágenes se realizó utilizando el software Fiji53.

Para preparar el extracto celular, se aisló el micelio15 cuidadosamente cultivado con el uso de un tamiz de tamaño de poro de 180 μm, luego se lavó 3 veces con PBS a 3000 × g, 4 min y 4 °C. Después de eliminar la humedad residual, el pellet se molió por congelación utilizando un mortero preenfriado con N2 líquido y se almacenó para su uso posterior a -80 °C. Aproximadamente 8 g del material molido congelado se lisaron en 20 ml de tampón de lisis (HEPES 100 mM pH 7,4, KCl 5 mM, NaCl 95 mM, MgCl2 1 mM, DTT 1 mM, glicerol al 5 %, EDTA 0,5 mM, Pefabloc 2.5 mM, Bestatina 130 μM, 10 μg mL–1 ADNasa, E-64 40 μM, Aprotinina 0,5 μM, Pepstatina A 60 μM, Leupeptina 1 μM), con 3 repeticiones de 6,5 mps de velocidad de agitación durante 25 s, 4 °C en un Homogeneizador de células Fastprep y 3 min de reposo en hielo después de cada repetición. Se utilizó un paso de centrifugación de 4000 × g para sedimentar los restos celulares más grandes y luego se realizó una centrifugación de alta velocidad de 100 000 × g. El sobrenadante resultante se filtró a través de un filtro centrífugo de corte de 100 KDa y se concentró a 30 mg·mL−1.

El sobrenadante filtrado, concentrado a 30 mg·mL−1, se aplicó a una columna de exclusión por tamaño Biosep SEC-S4000 que está montada en un sistema ÄKTA Pure 25 M FPLC (Cytiva, EE. UU.) a través de un bucle de 500 μL. La columna se equilibró con un tampón filtrado y desgasificado que contenía 200 mM de CH3COO-NH4+ a pH 7,4 antes de la aplicación de la muestra. El volumen de la fracción se fijó en 250 μL y el caudal en 0,15 mL·min−1. Sobre la base de los datos de MS adquiridos (véanse los detalles a continuación), se seleccionó la fracción 6 para probar su idoneidad como extracto celular productor de succinil-CoA.

Con el fin de producir una muestra de levadura equivalente para la comparación de actividad enzimática, se cultivó la cepa Saccharomyces cerevisiae de ATCC (American Type Culture Collection PO Box 1549 Manassas, VA 20108 USA; ATCC® 24657TM) en medio YPDG a 30 °C durante 5 h. a una OD595 de 2,5 (fase exponencial temprana), luego se cosecha a 3000 × g durante 5 min a 4 °C y se lava con agua destilada (sedimento resultante ~7 g). El protocolo posterior hasta la preparación final de la muestra es idéntico a la preparación de C. thermophilum descrita anteriormente.

El ensayo de actividad de OGDH fue adaptado de54. El ensayo enzimático se preparó en un volumen de reacción de 100 µL a 4 °C, que contenía NaCl 100 mM, K2HPO4 30 mM (pH 7,5), MgCl2 2 mM, ThDP 2 mM, α-cetoglutarato 4 mM, NAD+ 3 mM, CoA y 4 µL de Cell Counting Kit 8 y 2 µL de lisado celular que contiene OGDH. Para los cálculos de KM, el α-cetoglutarato se tituló de 50 a 5000 µM, NAD+ de 25 a 5000 µM y CoA de 5 a 1000 µM. La mezcla de reacción (sin α-cetoglutarato) se preincubó durante 5 min a 37 °C para los cálculos de KM del sustrato y de 25 °C a 65 °C con intervalos de 5 °C para la caracterización cinética dependiente de la temperatura, y comenzó la reacción. por la adición de α-cetoglutarato. La formación de producto de formazán por WST-8 del kit de conteo de células 8 se controló cada minuto durante 1 h a 460 nm, y la concentración se calculó con Lambert-Beer-Equation y el coeficiente de absorción molar de WST-855 (ε = 3,07 × 104 M −1cm−1). Debido a la inhibición del exceso de sustrato, las velocidades de reacción se representaron gráficamente frente a las concentraciones de sustrato mediante el gráfico doble recíproco de Lineweaver-Burk56, y los valores de KM se determinaron en el punto de intersección de abscisas de la regresión lineal asintótica.

Para los experimentos de Western Blot (WB), se usaron geles de 1 mm de espesor moldeados internamente, recién preparados, con la siguiente composición: fase de separación: Tris-HCl 370 mM pH 8,8, acrilamida al 10 % p/v (37,5:1), APS al 0,04 % p/v, TEMED al 0,002 % v/v, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1 % p/v en ddH2O, fase de apilamiento: Tris-HCl 125 mM pH 6,8, acrilamida al 5 % p/v (37,5:1) , 0,04 % p/v APS, 0,002 % v/v TEMED, 0,1 % p/v SDS en ddH2O. Las muestras se mezclaron previamente con un colorante de carga 4x (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 40 % v/v de glicerol, 20 % v/v de β-mercaptoetanol, 0,2 % p/v de azul de bromofenol, 8 % p/v de SDS) y luego se incubó a 100 °C durante 5 min. Para cada muestra nativa, se cargaron alrededor de 400 ng de proteína en cada carril y se cargaron 5 μL de Precision Plus Protein™ All Blue Prestained Protein Standards (Biorad, EE. UU.) en cada gel como marcador. La concentración de las muestras de control recombinantes fue de alrededor de 8 ng. Después de la carga, siguió la electroforesis en gel en un tampón de electroforesis 1X, recién diluido de un stock 10X (144 g de glicina, 30,3 g de Tris-base en ddH2O) con un campo eléctrico aplicado de 100 V durante 1,5 h. Se usó un Trans-Blot® Turbo Transfer System (Biorad, EE. UU.) para transferir el contenido del gel a una membrana de nitrocelulosa durante 20 min, con un campo aplicado preestablecido de 25 V (1 A). El bloqueo se realizó durante 1 h, con agitación constante en solución de TBST/leche al 5 % p/v y luego las membranas se incubaron a 4 °C durante 16 h con el anticuerpo primario (todas las concentraciones de anticuerpo aplicadas se ajustaron a 0,2 μg·mL− 1, 2% p/v TBST/leche). Se eliminó el anticuerpo primario y siguieron tres pasos de lavado de TBST/leche al 2% p/v. A continuación, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario (Goat Anti-Rabbit IgG, Abcam, ab205718, 0,1 μg·mL−1, 2% p/v TBST/leche) durante 1 h. Se aplicaron tres pasos de lavado más de 2% p/v de TBST/leche y, finalmente, las membranas se examinaron con un sistema ChemiDoc MP Imaging (Biorad, EE. UU.) y una mezcla fluorescente ECL recién mezclada y tiempos de exposición óptimos. Todos los anticuerpos primarios fueron hechos a medida por GenScript (Nueva Jersey, EE. UU.) y las secuencias de antígenos utilizadas para generar los anticuerpos se describen aquí: (a) la proteína E1o α/β tiene una secuencia recombinante que abarca Met-E1o611-818-His6 y una peso molecular (MW) de 24.014,67 Da; (b) la proteína E2o tiene una secuencia recombinante que abarca Met-E2o39-420-His6 y un peso molecular de 42.485,91 Da; y (c) la proteína E3 α/β tiene una secuencia recombinante que abarca Met-E335-504-His6 y un peso molecular de 51.341,91 Da.

Para la caracterización estructural del extracto celular productor de succinil-CoA, se aplicó una muestra de 3,5 μL con una concentración final de proteína de 0,3 mg·mL−1 sobre una película de soporte perforada recubierta de carbono tipo R2/1 sobre una rejilla de cobre de malla 200 (Quantifoil, Alemania) que previamente se descargó por incandescencia en las siguientes condiciones: 15 mA, red negativa, 0,4 mbar y 25 s de tiempo de incandescencia con un PELCO easiGlow (TED PELLA, EE. UU.). A continuación, la rejilla se congeló por inmersión con un sistema Vitrobot® Mark IV (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) después de secar con papel de filtro Vitrobot® (papel de filtro sin cenizas de grado 595 de ø55/20 mm). En la cámara, las condiciones se estabilizaron a 4 °C y 95 % de humedad, mientras que los parámetros de transferencia se establecieron en 0 fuerza de transferencia y 6 s de tiempo de transferencia. La rejilla vitrificada se cortó y cargó en un microscopio electrónico de transmisión criogénica Glacios 200 keV (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) en condiciones criogénicas y de baja humedad. Las imágenes se adquirieron con el detector de electrones directo Falcon 3EC y el software EPU (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) en modo lineal y una dosis total de electrones de 30 e−/Å2. Antes de la adquisición, el haz se alineó para que fuera paralelo y perpendicular a la muestra, con un diámetro de 2,5 μm, mientras que una apertura del objetivo de 100 μm restringía el ángulo del objetivo. Los parámetros de adquisición completos se enumeran en la Tabla complementaria 1.

Todos los pasos del procesamiento de imágenes se realizaron con el software informático de alto rendimiento cryoSPARC versión 3.3.157. Se importó un conjunto de datos de 25 803 películas a un espacio de trabajo dedicado. Los algoritmos de corrección de movimiento de parche en el software (multi) y estimación de CTF de parche (multi) se emplearon para corregir el movimiento inducido por el haz y calcular los parámetros CTF de las micrografías, respectivamente. Después de la curación del conjunto de datos, se seleccionaron 24 300 micrografías para los pasos posteriores del proceso de análisis de imágenes. Las plantillas se crearon a partir del EMD-1384416 con el trabajo de creación de plantillas (20 plantillas generadas con el mismo espacio) y se emplearon para un trabajo de selección con el selector de plantillas, lo que dio como resultado un conjunto de datos inicial de 3 596 302 partículas que se extrajo con un tamaño de cuadro de 208 píxeles . y luego 2D sin referencia clasificado en 200 clases. A partir de la clasificación 2D inicial, se seleccionaron 71 912 partículas de 4 clases y se sometieron a un refinamiento heterogéneo, refinando aún más el conjunto de partículas final a 52 034 partículas después de descartar partículas que dieron como resultado estructuras de núcleo OGDHc E2o mal formadas. El conjunto de partículas final se amplió simétricamente con simetría octaédrica (O) y se empleó para la reconstrucción final del núcleo con el (nuevo) trabajo de refinamiento local, lo que resultó en un mapa de núcleo OGDHc E2o con una resolución de 3,35 Å (criterio Gold-standard FSC 0,143) ( Figura complementaria 3A). Para la reconstrucción del complejo OGDH completo, las 71.912 partículas que se incluyeron en la reconstrucción del núcleo se volvieron a extraer con un tamaño de caja mayor de 288 pix para incluir la señal de las subunidades que se encuentran en la periferia del núcleo. Luego se reclasificaron en 20 clases 2D y las clases que mostraron densidades periféricas más prominentes se usaron nuevamente como plantilla para una nueva ronda de selección de plantilla, lo que resultó en un conjunto de partículas inicial de 2,891,518 partículas individuales. Este conjunto de partículas se sometió a 3 rondas más de clasificación 2D, siempre seleccionando promedios de clase que mostraban una señal central robusta, pero además del núcleo también mostraban una señal de subunidad periférica, terminando con un conjunto de 52 551 partículas que finalmente se usaron para una clasificación 3D trabajo con 10 clases. La clase 0, que contiene 5178 partículas y muestra las densidades periféricas mejor resueltas, finalmente se usó para un refinamiento homogéneo, lo que resultó en un mapa OGDHc de resolución 21.04 Å (criterio FSC estándar dorado 0.143) (Fig. 9D complementaria) que luego se utilizó para todos los análisis estructurales. Toda la visualización del mapa se realizó con el paquete de software ChimeraX58.

Para el refinamiento de la estructura central de E2o, el modelo inicial (ID de PDB: 7Q5Q) se ajustó a la densidad crio-EM con ChimeraX y luego se refinó con un refinamiento manual iterativo con Coot59 y un refinamiento en espacio real con Phenix60 con parámetros estándar. La densidad visible que podía cartografiarse se amplió hacia el N-ter de la E2o, desde M195 hasta E188.

Se utilizó una instalación local de AlphaFold-Multimer28 para realizar predicciones del trímero de vértice del núcleo E2o que se modeló en el mapa derivado experimentalmente, el dímero E1o (Uniprot ID: G0RZ09) y el dímero E3 (Uniprot ID: G0SB20) en complejo con el dominio E2o LD anotado por Uniprot (números residuales 40–115, ID de Uniprot: G0SAX9). Todas las métricas de calidad basadas en AlphaFold2 (error alineado previsto (PAE) y prueba de diferencia de distancia local prevista (plDDT) se pueden encontrar en la figura complementaria 5A, B. Para calcular y visualizar todas las superficies electrostáticas, se utilizó el complemento de electrostática APBS61 en PyMol (Schrodinger, EE. UU.).

Se aplicaron dos protocolos distintos para los cálculos informados de HADDOCK2.2: (a) refinamiento de HADDOCK62. Aquí, el protocolo de refinamiento se aplicó para calcular y comparar la energía de las interfaces entre los componentes de OGDHc y su homólogo humano, así como las interfaces generadas por AlphaFold2 formadas por el LD. En este procedimiento de refinamiento, solo se realizó la etapa de refinamiento del agua del protocolo HADDOCK que mostró una correlación cualitativa de la energía calculada con las afinidades de unión para las interacciones transitorias proteína-proteína25 omitiendo el paso de acoplamiento. Para ello, los complejos se solvataron en una capa de 8 Å de agua TIP3P. El protocolo constaba de los siguientes pasos: (1) 40 pasos EM con la proteína fijada (minimizador de Powell) y (2) 2 × 40 pasos EM con restricciones de posición armónica en la proteína (k = 20 kcal·mol−1 Å−2 ). Para el refinamiento final del agua, después del paso (2) se introduce un protocolo de recocido simulado suave que usa dinámica molecular en el espacio cartesiano. Consiste en: (1) Período de calentamiento: pasos de 500 MD a 100, 200 y 300 K. Se aplican restricciones de posición (k = 5 kcal·mol−1 Å−2) a la proteína excepto a las cadenas laterales en la interfaz . (2) Etapa de muestreo: 1250 pasos MD. Se aplican restricciones de posición débiles (k = 1 kcal·mol-1 Å-2) a la proteína excepto para la columna vertebral y las cadenas laterales en la interfaz; y (3) Etapa de enfriamiento: pasos de 500 MD a 300, 200 y 100 K. Se aplican restricciones de posición débiles (k = 1 kcal·mol-1 Å-2) en la estructura principal de la proteína excepto en la interfaz. Se utiliza un paso de tiempo de 2 fs para la integración de la ecuación de movimientos y la temperatura se mantiene constante mediante acoplamiento débil a un baño de temperatura de referencia utilizando el termostato Berendsen63. Los cálculos se realizaron con CNS64. Las interacciones no enlazadas se calcularon con el campo de fuerza OPLS65 utilizando un límite de 8,5 Å. El potencial electrostático (Eelec) se calculó utilizando una función de cambio, mientras que se utilizó una función de conmutación (entre 6,5 y 8,5 Å) para definir el potencial de Van der Waals (Evdw). Los cálculos de la estructura se realizaron en el servidor web HADDOCK en https://alcazar.science.uu.nl/ utilizando la interfaz de refinamiento. Se generó un total de 200 estructuras para cada complejo. (b) Atraque flexible Eglefino. Se utilizó el servidor de acoplamiento HADDOCK, utilizando la interfaz gurú. Aquí, las restricciones de distancia se usaron aplicando los datos de entrecruzamiento derivados que coinciden con los residuos de LYS de LD y E1 y E3, respectivamente. Las restricciones de distancia aplicadas se incluyen en los archivos haddockparam.web proporcionados con este artículo. Para los cálculos de acoplamiento, la interfaz de gurú se utilizó de forma predeterminada, pero el espacio de búsqueda y puntuación se amplió significativamente. Esto significó que las estructuras generadas se incrementaron a N = 10,000 y las estructuras puntuadas se incrementaron a N = 400. Los cálculos de los residuos de aminoácidos frecuentes involucrados en la unión de la LD se produjeron a partir de las interfaces formadas de la N = 400 final, agua- soluciones de acoplamiento refinadas. Se considera un residuo de interfase si está cerca de 5 Å de cualquier otro residuo del LD. Los residuos informados con alta frecuencia son los que pertenecen al cuartil superior (por encima del 25 %) en las frecuencias calculadas por residuo y se graficaron con el servidor web en línea BoxPlotR66.

El mapa complejo OGDHc que se generó a partir de los datos experimentales crio-EM se utilizó para identificar la ubicación de las subunidades periféricas E1o y E3, en complejo con el dominio E2o LD que se generó a través de predicciones AlphaFold-Multimer de la siguiente manera: el mapa se mostró en ChimeraX y después de colocar el núcleo E2o en el centro, se segmentó en una región "núcleo" y una región de densidad "externa" con la herramienta de mapa de segmentos. Luego se realizó una búsqueda de ajuste de 100 ajustes para los complejos E1o-LD y E3-LD y los valores de correlación cruzada (CC) para cada ajuste se enumeraron y separaron como ajuste en la región central o de densidad externa. Para la significación estadística, los dos grupos de ajuste de CC se probaron con análisis de varianza de un solo factor (ANOVA) con el paquete de herramientas de análisis en Microsoft Excel (Microsoft Corporation, EE. UU.) y los valores para los ajustes se pueden encontrar en las figuras complementarias 10A, B y Datos complementarios 3. Los gráficos CC se trazaron con el servidor web en línea BoxPlotR.

Los cálculos de la distancia del enlazador E2o de C. thermophilum se realizaron de la siguiente manera: (a) Para las mediciones de distancia resueltas experimentalmente, después de que todas las subunidades periféricas con LD unido se ajustaran en el mapa complejo OGDH, la distancia se midió con el comando "distancia" en ChimeraX, comenzando desde el último residuo N-ter resuelto para cada una de las 3 subunidades E2o del trímero de vértice central E2o más cercano inspeccionado visualmente, hasta los primeros residuos C-ter del dominio LD modelado unido a dímeros E1o o E3 en la periferia. Luego se promediaron todos los valores, y las mediciones individuales y las desviaciones estándar calculadas se pueden encontrar en los Datos complementarios 3. Los cálculos teóricos basados en la longitud desordenada del enlazador (73 aa, Uniprot ID: G0SAX9) luego se basaron en ecuaciones derivadas publicadas por Marsh y Forman-Kay41 , Wilkins et al.67 y George y Heringa42. Además, para obtener más información sobre la longitud del enlazador desordenado en función de las estructuras resueltas experimentalmente del PDB, se descargó la base de datos completa del PDB, a partir del 1 de junio de 2022, y se descargaron un total de 191 144 archivos en formato mmCIF, que contenían más de medio millón de cadenas. analizado. Las regiones del enlazador faltantes con sus secuencias correspondientes se identifican a partir de las entradas "_pdbx_unobs_or_zero_occ_residues" en los archivos mmCIF y se registraron un total de 399 404 regiones faltantes. Para cada entrada de región faltante, los aminoácidos observados izquierdo y derecho se identifican utilizando los datos de coordenadas atómicas en los archivos mmCIF. Para cada región enlazadora, se derivan las siguientes propiedades (a) la distancia Ca-Ca de extremo a extremo entre los dos residuos observados, medida en Å, (b) la longitud de la región enlazadora y (c) la secuencia de la región enlazadora. Las longitudes de estas regiones faltantes variaron desde 1 aminoácido hasta 3736 aminoácidos, y se observó una fuerte reducción de las entradas de PDB disponibles al aumentar la longitud de la secuencia del enlazador, con la tendencia visible en la Fig. 10E complementaria. Para obtener mejores propiedades colectivas, los archivos se agruparon aumentando de forma adaptativa el ancho del contenedor de la longitud de los aminoácidos. Para 1–50 aminoácidos, el ancho del contenedor se mantuvo en 1. A partir del 50, el borde derecho del contenedor aumenta gradualmente, a 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 250 y 4000. De las entradas cayendo en cada bin, se calculó el valor medio de las distancias Ca-Ca, y la distancia en los cuantiles varió de 0,0 a 1,0 en pasos de 0,2. Los datos analizados se presentan en Datos complementarios 4. En la Fig. 9A, la distancia media Ca-Ca, representada por puntos negros, se representó frente a la longitud de la región del enlazador. Las distancias al nivel del cuantil (0,0–1,0) se trazaron como un tono de color como se indica en la leyenda. Como referencia, se trazó una línea horizontal (azul punteada) correspondiente a 3,5 Å. De manera similar, se trazó una línea (azul continua) correspondiente a 7 Å veces la longitud de la región faltante. La relación entre la distancia media Ca-Ca (y) y el número de aminoácidos de la secuencia faltante (x) se puede caracterizar empíricamente mediante una función modelo de la forma: \(y=A\left(1-{e} ^{-{bx}}\right)+3.5\), donde se observa que las constantes A y b tienen valores de 11 y 0.2, respectivamente. La función del modelo se trazó como una línea roja. Todos los gráficos relacionados con los cálculos de distancia PDB (Fig. 9A, Fig. 10D, E complementaria) se generaron con el paquete Pandas en Python 3.9. El gráfico de burbujas que contiene todos los cálculos de distancia teóricos y experimentales (Fig. 10C complementaria) se generó con el paquete ggpubr 0.4.0 en R.

Los cálculos de desplazamiento rotacional de las subunidades del trímero de vértice E2o de H. sapiens frente a las subunidades del trímero de vértice E2o de C. thermophilum resueltas experimentalmente (A, B, C) se realizaron de la siguiente manera: primero, C. thermophilum y H. sapiens (PDB ID: 6H05 ) Los trímeros E2o se extrajeron y alinearon sobre la subunidad A en PyMol. Luego, se usó el comando "angle_ between_domains" para calcular primero el ángulo entre la subunidad A y B de C. thermophilum. Se hizo lo mismo para el ángulo entre la subunidad A de C. thermophilum y la subunidad B de H. sapiens. Luego se restaron los valores. Se realizó el mismo proceso para el par de subunidades A y C, nuevamente manteniendo el mismo eje de rotación, alineado en la subunidad A. Se puede ver una representación visual de los dominios medidos en la Fig. 4A complementaria.

Las fracciones 3–9 del fraccionamiento del lisado nativo de C. thermophilum descrito anteriormente se agruparon en dos grupos (3–6 y 7–9). De cada grupo, se digirieron 40 μL de muestra en solución con tripsina como se describió anteriormente68,69. Para evitar la precipitación de proteínas durante la reducción y alquilación de la muestra, se agregaron 2 μL de SDS al 20 %. Se añadió 1 μL de DTT 200 mM en HEPES/NaOH 200 mM pH 8,5 para reducir las muestras de proteína, que luego se incubaron a 56 °C durante 30 min. Después de la reducción, siguió la alquilación con la adición de 2 μL de cloroacetamida 400 mM en HEPES/NaOH 200 mM, pH 8,5 y otra incubación a 25 °C durante 30 min. Todo el exceso de cloroacetamida se extinguió mediante la adición de 2 μl de DTT 200 mM en HEPES/NaOH, pH 8,5. Después de la reducción y la alquilación, las muestras se usaron para la preparación de muestras mejoradas en fase sólida en un solo recipiente68,69. Para esta preparación, se agregaron 5 μL de ácido fórmico al 10 % v/v y 2 μL de Sera-Mag Beads, junto con suficiente acetonitrilo (ACN) para lograr un porcentaje final de ACN del 50 % v/v, seguido de 8 min incubación y captura de perlas en una gradilla magnética. Luego, las perlas se lavaron dos veces con la adición de 200 μL de etanol al 70 % y una vez más con 200 μL de ACN. Después de la resuspensión en 10 μl de 0,8 μg de tripsina modificada de grado de secuenciación en 10 μl de HEPES/NaOH 100 mM, pH 8,5, las perlas se incubaron durante la noche a 37 °C. A la incubación le siguió un paso de limpieza de fase inversa y luego se analizó mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con un espectrómetro de masas Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ (ThermoFisher Scientific, EE. UU.). Más específicamente, se utilizó un UltiMate™ 3000 RSLCnano System (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) equipado con un cartucho de captura y una columna analítica para la separación de péptidos. Para el disolvente A se utilizó ácido fórmico al 0,1 % v/v en agua de grado LC-MS y para el disolvente B ácido fórmico al 0,1 % v/v en CAN de grado LC-MS. Todos los péptidos se cargaron en el cartucho de captura con un flujo fijo de solvente A de 30 mL·min-1 durante 3 min y se eluyeron con 0,3 mL·min-1 durante 90 min de tiempo de análisis, comenzando con un 2–28 % de solvente B elución, luego aumento a 40% B, otra etapa de lavado con 80% B y finalmente reequilibrio a las condiciones iniciales. El sistema LC se acopló directamente al espectrómetro de masas mediante una fuente de iones Nanospray-Flex y un emisor Pico-Tip de 360 μm de DE × 20 μm de DI; punta de 10 micras. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de iones positivos con un voltaje de pulverización de 2,3 kV y una temperatura capilar de 275 °C. Los espectros de MS de barrido completo con un rango de masas de 350–1400 m/z se adquirieron en modo de perfil usando una resolución de 70 000 [tiempo de llenado máximo de 100 ms o un máximo de 3e6 iones (control automático de ganancia, AGC)]. La fragmentación se activó para los 20 picos principales con carga 2-4 en el escaneo de MS (adquisición dependiente de datos) con una ventana de exclusión dinámica de 20 s (la energía de colisión normalizada fue 26). Los precursores se aislaron con 1,7 m/z y los espectros MS/MS se adquirieron en modo de perfil con una resolución de 17 500 (tiempo de llenado máximo de 50 ms o un objetivo AGC de 1e5 iones). Para el análisis de datos, los datos sin procesar de MS fueron analizados por MaxQuant 1.6.170. Las secuencias de proteomas de Chaetomium thermophilum se descargaron de Uniprot con Proteome ID UP000008066. Los datos de MS se buscaron frente a las secuencias de proteomas de Chaetomium thermophilum más la secuencia de contaminantes comunes proporcionada por MaxQuant. La configuración predeterminada de MaxQuant se usó con oxidación de modificación y acetilo (término N de proteína). Se usó un límite de tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1 % para la identificación de proteínas, y se usó la intensidad iBAQ para la cuantificación de proteínas sin etiquetas. Al calcular la intensidad de iBAQ, se usaron las intensidades máximas de los picos del detector del perfil de elución del péptido como la intensidad del péptido. Luego, todas las intensidades de péptidos identificados se agregaron y normalizaron por el número total de péptidos identificados.

Para la preparación de las muestras de espectrometría de masas de reticulación, primero se realizó una titulación para identificar la concentración óptima de reticulante (Fig. 7 complementaria). Las fracciones 3–9 del fraccionamiento del lisado nativo de C. thermophilum descrito anteriormente (Fig. 7A complementaria) se agruparon hasta un volumen total de 1,4 ml y una concentración de proteína de 0,48 mg·ml−1, luego se dividieron en 7 partes de igual volumen en cada una. tubo Eppendorf. En el primer tubo no se añadió reticulante para quedar como control, mientras que al resto se añadieron 5 μL de 0,16, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5 y 5 mM del reticulante BS3 respectivamente. Las muestras se incubaron durante 2 h en hielo y luego se desactivó la reacción de entrecruzamiento con la adición de NH4HCO3 50 mM, se incubaron nuevamente durante 30 min en hielo. Luego, las muestras se transfirieron a un tubo compatible con acetona y se agregó 4 veces el volumen de muestra de acetona fría (-20 °C), los tubos se agitaron con vórtex, se incubaron nuevamente durante 60 min a -20 °C y se centrifugaron durante 10 min a 15.000 × gr. Se eliminó adecuadamente el sobrenadante y luego se dejaron los tubos abiertos a temperatura ambiente para que se evaporara la acetona. Para visualizar los resultados de la titulación, cada uno de los gránulos de los 7 tubos se resuspendió en tampón de carga de muestra SDS-PAGE 1X (diluido de una reserva 4X de Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, dodecilsulfato de sodio al 8 % p/v (SDS), azul de bromofenol al 0,2 % p/v, glicerol al 40 % v/v, β-mercaptoetanol al 20 % v/v) hasta una concentración final de proteína de 10/20 μg·mL−1. Luego, las muestras se hirvieron durante 5 min a 90 °C, se cargaron en geles prefabricados Mini-PROTEAN® (BioRad, EE. UU.) y se electroforizaron durante 60 min a 150 V. Después de la electroforesis, los geles se lavaron dos veces en agua, se tiñeron con tinción de Coomassie. solución y luego se destiñó hasta que el fondo del gel se destiñó por completo. Después de la inspección visual de los geles, se seleccionó una concentración óptima de BS3 1 mM para proceder con la reticulación de la muestra (Fig. 7B complementaria). Con la concentración óptima de reticulante determinada, las fracciones 3–9 del fraccionamiento del lisado nativo de C. thermophilum descrito anteriormente se agruparon nuevamente, pero esta vez en dos grupos, 3–6 y 7–9. En un tubo Eppendorf Protein LoBind para cada combinación, se añadieron 100 μL de urea 8 M y luego se centrifugaron durante la noche en un evaporador centrífugo al vacío a temperatura ambiente. Luego se transfirieron 100 μL de cada pool a cada uno de los tubos que contenían urea en polvo y se agregó 100 mM de bicarbonato de amonio (ABC). A continuación, también se añadió DTT a una concentración final de 2,5 mM (de una reserva de DDT 100 mM disuelta en ABC 100 mM) y se incubó durante 30 min a TA. Una vez finalizada la incubación, se añadió 2-yodoacetamida (IAA) hasta una concentración final de 5 mM seguido de incubación durante 30 min, a TA en la oscuridad. La reacción se inactivó mediante la adición de DTT 2,5 mM para evitar la modificación de la serina en los sitios activos de la tripsina. Posteriormente se añadió LysC (1 μg μL−1 stock, en proporción 1:100, p/p) y las muestras se incubaron nuevamente a temperatura ambiente durante 4,5 h. Una adición de ABC 50 mM a la muestra redujo la concentración de urea a <2 M. Se introdujo tripsina (de 1 μg μL−1 de stock, en una proporción de 1:50, p/p) en las muestras que luego se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. , seguido del procedimiento de desalinización TIPS STop And Go Extraction (STAGE), tal y como se describe en la ref. 71. Las muestras de péptidos entrecruzados finales se sometieron al mismo proceso de LC-MS/MS y los resultados se analizaron como se describe anteriormente en el método de identificación de proteínas de MS. Todos los gráficos, que visualizan los datos de MS/XL-MS, se crearon con el servidor web en línea xiVIEW72.

Las proteínas identificadas de la espectrometría de masas se mapearon en los conjuntos de orden superior proporcionados descritos en Kastritis et al. (2017)19. Estos ensamblajes de orden superior se enriquecieron aún más mediante la búsqueda de homología por entrada Uniprot en el Protein Data Bank, para incluir también posibles subunidades homólogas resueltas en estructuras PDB después de 2017. Para esto, se utilizó Blastp (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) de forma predeterminada en la base de datos PDB. A continuación, las redes y comunidades proporcionadas en Kastritis et al. (2017) sirvieron de base para expandir aún más las redes reportadas en este estudio. Esto se realizó asignando las proteínas a esas redes, incluyéndolas en la base de datos STRING73 y expandiendo las interacciones identificadas en una red con comunidades e interactuantes de primera y segunda capa. Luego, se recuperaron los grupos de redes STRING locales específicos de C. thermophilum y la cobertura por grupo de cadenas se informa mediante la división simple de las proteínas identificadas sobre todas las proteínas presentes en el grupo STRING. Esto se realizó a partir de estas redes expandidas a través de mapeo inverso a los datos de MS y XL-MS. Finalmente, se verificó la importancia biológica de las redes utilizando el criterio de detección de enriquecimiento en la base de datos74, lo que muestra que los 54 grupos (comunidades de proteínas) derivados aquí estaban significativamente enriquecidos en interacciones biológicas. La visualización de las redes se realizó con Cytoscape75. La recuperación del ciclo completo de TCA se infirió utilizando KEGG76.

Uniprot ID: G0S3G5 (holocitocromo C sintasa putativo de C. thermophilum - longitud de secuencia: 382), Uniprot ID: Q7S3Z3 (caracterizado en 13 como la proteína N. crassa Kgd4 - longitud de secuencia: 130), junto con Uniprot ID: Q7S3Z2 (N. crassa supuesta holocitocromo C sintasa - longitud de secuencia: 317) se descargaron en formato .fasta de la base de datos Uniprot y se alinearon con Clustal Omega77 en dos pares de alineación separados: G0S3G5 con Q7S3Z3 y G0S3G5 con Q7S3Z2 por separado. Los archivos .aln fueron descargados y visualizados con Jalview78. Los resultados de la alineación se muestran en la Fig. 8 complementaria. Las identificaciones de proteínas en Uniprot se han actualizado, con P9WES7 ahora correspondiente a la supuesta holocitocromo C sintasa (longitud: 287 aa) y P9WES8 a la E3BPo identificada (longitud: 135 aa).

Los modelos derivados de AlphaFold2 para todas las proteínas implicadas en la formación del metabolón OGDHc, a saber, E1o, E2o y E3, se validaron en cuanto a su calidad mediante el empleo de enlaces cruzados intramoleculares derivados del análisis de enlaces cruzados realizado anteriormente. Todos los enlaces cruzados intramoleculares identificados de E1o, E2o y E3, respectivamente, se mapearon en los modelos correspondientes mediante el uso de un script interno de Python y se evaluaron manualmente para determinar su viabilidad. Las distribuciones de distancia se trazaron para cada modelo en la Fig. 9A complementaria, y los datos correspondientes se incluyen en los Datos complementarios 2.

Todos los análisis estadísticos realizados se describen adecuadamente en cada una de las subsecciones de Métodos e incluyen métodos estadísticos aplicados para el análisis, intervalos de confianza, número de réplicas biológicas, número de réplicas técnicas, desviaciones estándar y puntuaciones de correlaciones cruzadas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de origen para todas las cifras se proporcionan con este documento en los elementos correspondientes de Datos complementarios. El mapa y modelo Cryo-EM para el núcleo nativo de 24 mer de la OGDHc se ha depositado en EMDB y PDB con los números de acceso EMD-16900 y 8OIU respectivamente. El mapa crio-EM asimétrico de la OGDHc se incluye en EMD-16900. Las películas en bruto, las micrografías resumidas y los atlas en cuadrícula se han depositado en EMPIAR con el número de acceso EMPIAR-11502. Los datos de espectrometría de masas están disponibles como Datos complementarios 2.

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Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio de Kastritis por sus fructíferos debates. Este trabajo fue apoyado por la Unión Europea a través de la financiación del proyecto número 101086665 de la Cátedra ERA de Horizon Europe "hot4cryo" (a PLK), el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF, programa ZIK) (subvenciones n.º 03Z22HN23, 03Z22HI2 y 03COV04 a PLK), los Fondos Europeos de Desarrollo Regional (EFRE) para Sajonia-Anhalt (subvención n.º ZS/2016/04/78115 a PLK), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (número de proyecto 391498659, RTG 2467) y la Universidad Martin-Luther de Halle -Wittenberg.

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Estos autores contribuyeron igualmente: Ioannis Skalidis, Fotis L. Kyrilis, Christian Tüting.

Centro de Investigación Interdisciplinario HALOmem, Centro de Proteínas Charles Tanford, Universidad Martin Luther Halle-Wittenberg, Kurt-Mothes-Strasse 3a, 06120, Halle/Saale, Alemania

Ioannis Skalidis, Fotis L. Kyrilis, Christian Tüting, Farzad Hamdi, Toni K. Träger, Jaydeep Belapure y Panagiotis L. Kastritis

Instituto de Bioquímica y Biotecnología, Universidad Martin Luther Halle-Wittenberg, Kurt-Mothes-Straße 3, 06120, Halle/Saale, Alemania

Ioannis Skalidis, Fotis L. Kyrilis, Toni K. Träger y Panagiotis L. Kastritis

Biozentrum, Universidad Martin Luther Halle-Wittenberg, Weinbergweg 22, 06120, Halle/Saale, Alemania

Gerd Hause y Panagiotis L. Kastritis

Departamento de Bioquímica Vegetal, Instituto de Bioquímica y Biotecnología, Universidad Martin Luther Halle-Wittenberg, Kurt-Mothes-Str. 3a, 06120, Halle/Saale, Alemania

Marta Fratini & Ingo Heilmann

Centro de Biología Estructural, Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer (NCI), Frederick, MD, 21702-1201, EE. UU.

Francis J. O'Reilly

Bioanalítica, Instituto de Biotecnología, Technische Universität Berlin, 13355, Berlín, Alemania

Muestra Rappsilber

Wellcome Center for Cell Biology, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Edimburgo, Edimburgo, EH9 3BF, Escocia, Reino Unido

Muestra Rappsilber

Instituto de Biología Química, Fundación Nacional de Investigación Helénica, Atenas, 11635, Grecia

Panagiotis L. Kastritis

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FLK llevó a cabo el trabajo experimental, asistido por FJO en espectrometría de masas y TKT en ensayos cinéticos. GH y MF realizaron imágenes de células. FH adquirió las micrografías. IS calculó las reconstrucciones crio-EM y realizó el modelado computacional. CT realizó el modelado computacional. JB realizó un análisis estadístico de las distancias del enlazador. PLK, IH y JR obtuvieron financiación. PLK concibió el proyecto. IS y PLK escribieron el manuscrito con contribuciones de todos los autores.

Correspondencia a Panagiotis L. Kastritis.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este manuscrito ha sido revisado previamente en otra revista de Nature Portfolio. El manuscrito se consideró adecuado para su publicación sin revisión adicional en Communications Biology. Editor principal de manejo: Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Skalidis, I., Kyrilis, FL, Tüting, C. et al. Análisis estructural de un metabolón endógeno generador de succinil-CoA de 4 megadaltones. Commun Biol 6, 552 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04885-0

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Recibido: 13 de marzo de 2023

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 22 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04885-0

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