ATG7 y ATG14 restringen la replicación citosólica y fagosomal de Mycobacterium tuberculosis en macrófagos humanos

Nature Microbiology volumen 8, páginas 803–818 (2023) Citar este artículo

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La autofagia es un mecanismo de defensa inmune innato celular contra los microorganismos intracelulares, incluido Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Sigue sin resolverse cómo funciona la autofagia canónica y no canónica para controlar la infección por Mtb en los fagosomas y el citosol. Los macrófagos son la principal célula huésped en humanos para Mtb. Aquí estudiamos las contribuciones de la autofagia canónica y no canónica en los macrófagos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos genéticamente manejables (iPSDM), utilizando un conjunto de mutantes de Mtb generados en el mismo fondo genético de la cepa de laboratorio común H37Rv. Supervisamos la replicación de mutantes de Mtb que no pueden desencadenar la autofagia canónica (Mtb ΔesxBA) o que, según se informa, no pueden bloquear la autofagia no canónica (Mtb ΔcpsA) en iPSDM que carecen de ATG7 o ATG14 utilizando imágenes de alto contenido de una sola célula. Informamos que la eliminación de ATG7 por CRISPR-Cas9 en iPSDM resultó en una mayor replicación de Mtb de tipo salvaje pero no de Mtb ΔesxBA o Mtb ΔcpsA. Mostramos que la eliminación de ATG14 resultó en una mayor replicación tanto de Mtb de tipo salvaje como de Mtb mutante ΔesxBA. Usando reporteros de Mtb e imágenes cuantitativas, identificamos un papel para ATG14 en la regulación de la fusión de fagosomas que contienen Mtb con lisosomas, lo que permite la restricción de bacterias intracelulares. Concluimos que tanto ATG7 como ATG14 son necesarios para restringir la replicación de Mtb en macrófagos humanos.

Se han implicado dos vías principales de autofagia en la defensa del huésped contra patógenos intracelulares: la vía canónica de xenofagia1,2,3 y una vía no canónica denominada fagocitosis asociada a LC3 (LAP)4,5. La xenofagia es una forma especializada de macroautofagia en la que la biogénesis del autofagosoma de novo captura bacterias en autofagosomas de doble membrana que se dirigen a los lisosomas6. La ruptura de las bacterias que contienen fagosomas desencadena la exposición de los restos de carbohidratos luminales al citosol que son reconocidos por las galectinas para iniciar la xenofagia7,8. La xenofagia también puede iniciarse por la ubiquitinación de proteínas y lipopolisacáridos del huésped y del patógeno durante el daño de la membrana, así como después del escape de bacterias al citosol9,10. En LAP, los miembros de la familia Atg8 de proteínas de autofagia se conjugan directamente con membranas fagosómicas individuales para permitir la maduración del fagosoma4. Se ha demostrado que la focalización de patógenos en LAP tiene diferentes resultados; en algunos casos es restrictivo, pero en otros promueve la replicación bacteriana5. Mecánicamente, LAP requiere la maquinaria de lipidación LC3 de Atg7, Atg3 y Atg5-12-16L1, así como el complejo PI3K (Beclin1, UVRAG, Rubicon, Vps34 y Atg101) y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) por la NADPH oxidasa . LAP no requiere los componentes del complejo ULK1 ni Atg14, ambos esenciales para la xenofagia11. A pesar de los avances recientes, la regulación espacial y temporal entre las respuestas de autofagia canónica (xenofagia) y no canónica (LAP) durante la infección con patógenos intracelulares sigue estando mal caracterizada en los macrófagos humanos.

Hay evidencia de que la xenofagia y LAP tienen un papel en la respuesta de los macrófagos del huésped a la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb)2,12. Por otro lado, Mtb entrega varios efectores bacterianos en las células huésped que interfieren con la autofagia13. Además, Mtb daña la membrana fagosomal y entra al citosol del huésped a través de la acción coordinada del Sistema de Secreción ESX-1 Tipo 7 (T7SS) codificado dentro de la región de diferencia 1 (RD1)14,15,16 y los lípidos de la pared celular ftiocerol dimicocerosatos (PDIM)17,18,19,20. La orientación de Mtb a la autofagia y la evasión por parte de Mtb es altamente dinámica y regulada temporalmente13,21. El daño inducido por Mtb a la membrana fagosómica induce estructuras autofagosómicas tubulovesiculares complejas (LC3-TVS)22. Después de la inducción de LC3-TVS, Mtb se segrega de las membranas autofagosomales, evadiendo la xenofagia y escapando al citosol22. La subpoblación fagosómica restante de Mtb manipula activamente la vía de maduración del fagosoma13. Sin embargo, para una subpoblación de bacterias que acceden al citosol, la orientación a la xenofagia probablemente sea exitosa y conduzca a su restricción. LAP no contribuye a la restricción de Mtb de tipo salvaje (WT) en macrófagos de ratón porque Mtb subvierte esta vía a través de la secreción de CpsA. CpsA bloquea la acción de la NADPH oxidasa y por lo tanto reduce la activación fagosomal de ROS y LAP12.

En los macrófagos de ratón, la interrupción de la vía de la autofagia por eliminación (KO) de genes de autofagia selectivos clave aumenta la replicación de Mtb12,23,24,25. Sin embargo, el KO condicional in vivo de varias proteínas de autofagia murina no alteró las cargas bacterianas de Mtb ni la supervivencia del ratón después de la infección26. Aunque está claro que Mtb puede restringirse de manera eficiente mediante respuestas de autofagia in vitro, estos resultados in vivo llevaron a la postulación de que la autofagia no es importante para el control de Mtb en el modelo de ratón con tuberculosis (TB)27, posiblemente debido a la subversión eficiente in vivo ; por lo tanto, el papel de la autofagia en la TB sigue sin estar claro.

Debido a la falta de sistemas genéticos robustos, anteriormente no ha sido factible utilizar enfoques de eliminación de genes específicos para estudiar el papel de la autofagia en los macrófagos humanos primarios. Tales enfoques podrían mejorar nuestra comprensión de la autofagia en la infección porque las caídas, o las estrategias de KO condicional, pueden dar como resultado la eliminación incompleta de todos los procesos de autofagia en las células huésped. En este artículo, para comprender mejor el papel de la autofagia en la eliminación de Mtb en humanos, desarrollamos un modelo de células de macrófagos humanos e investigamos los roles de ATG7 y ATG14 en la replicación bacteriana y la muerte celular.

Para investigar el papel de la respuesta de autofagia a la infección por Mtb en macrófagos humanos y reducir las inconsistencias asociadas con los cambios en el fondo genético de la cepa parental, generamos dos mutantes de eliminación de genes y cepas complementadas afines, en el fondo Mtb H37Rv. Primero, generamos una cepa que carecía tanto de EsxA como de EsxB (Mtb ΔesxBA), dos sustratos de ESX-1 T7SS que son responsables del daño del fagosoma y la inducción de xenofagia (Fig. 1a)28,29. La eliminación de esxBA se confirmó sondeando las proteínas EsxA y EsxB tanto en el lisado de células completas como en el filtrado de cultivo mediante transferencia Western (Fig. 1b). Como era de esperar, no se detectaron EsxA ni EsxB ni en el filtrado de cultivo ni en el lisado de células enteras de Mtb ΔesxBA o Mtb ΔRD1, que se utilizó como control. El mutante Mtb ΔesxBA se complementó colocando la expresión tanto de Mtb H37Rv esxB como de esxA bajo el control del potente promotor 30 de Psmyc en el sitio MS6 del cromosoma. La expresión y secreción de las proteínas EsxA y EsxB complementadas se validó mediante transferencia Western (Fig. 1b). A continuación, generamos una segunda cepa mutante que carece de CpsA (Mtb ΔcpsA), que se informa que no puede bloquear LAP en macrófagos12 (Fig. 1c). El mutante Mtb ΔcpsA se complementó con la integración cromosómica del gen cpsA colocado bajo el control del promotor fuerte hsp60 en el sitio MS6. La producción y secreción de EsxA y EsxB no se vio afectada en Mtb ΔcpsA y Mtb ΔcpsA:cpsA (Fig. 1d). Es importante destacar que los perfiles de replicación in vitro (Fig. 1e, f) y la producción de PDIM de estas cepas fueron similares en medios líquidos 7H9, lo que indica que la replicación extracelular no se vio afectada (Fig. 1g). Todas las cepas recombinantes generadas se transformaron luego con vectores que codifican la proteína fluorescente E2-Crimson y sus perfiles de replicación en iPSDM se analizaron más a fondo mediante imágenes de alto contenido y análisis unicelulares. La absorción de Mtb por los macrófagos no se vio afectada por las deleciones de esxA/esxB o cpsA (Fig. 1h). Sin embargo, la replicación de Mtb ΔesxBA se redujo en iPSDM después de 96 h de infección (Fig. 1i, j). Se observó una reducción similar después de la infección de iPSDM con el mutante Mtb ΔcpsA (Fig. 1k, l). La complementación de Mtb ΔesxBA y Mtb ΔcpsA con genes funcionales esxBA o cpsA restauró su capacidad para replicarse en macrófagos (Fig. 1i-l).

a, c, Mtb esxBA-rv3874-75 locus (a) y cpsA-rv3484 locus (c) en Mtb WT y las cepas de deleción respectivas. Las semiflechas negras representan las posiciones de los cebadores (CmR, resistencia al cloranfenicol; ZeoR, resistencia a la zeocina; Prom., promotor groEL). b, d, Western blot de EsxA y EsxB de lisados ​​celulares totales y filtrados de cultivo de cepas Mtb WT, ΔRD1, ΔesxBA, ΔesxBA:BA (n = 3) (b) o Mtb WT, ΔcpsA y ΔcpsA:cpsA (n = 1 ) (d). Se usó Ag85 como control de carga. e, Curvas de crecimiento de Mtb WT, ΔesxBA y ΔesxBA:BA. f, Curvas de crecimiento de las cepas Mtb WT, ΔcpsA y ΔcpsA:cpsA. g, análisis de cromatografía en capa fina de PDIM de cultivos Mtb WT, ΔcpsA, ΔcpsA:cpsA, ΔesxBA y ΔesxBA:BA (n = 1). Se utilizaron como controles PDIM purificado y extractos de Mtb ΔPDIM. h, análisis cuantitativo del área de Mtb WT, ΔesxBA, ΔesxBA:BA (arriba) y Mtb WT, ΔcpsA, ΔcpsA:cpsA (abajo) por célula individual, 2 h después de la infección. Datos representativos de tres experimentos independientes (n = 3 pozos independientes). Los resultados se muestran como media ± error estándar de la media (sem). ANOVA unidireccional siguió con la prueba de comparación múltiple de Šídák. NS, no significativo. i, Instantánea de iPSDM vivo infectado con Mtb WT, ΔesxBA y ΔesxBA:BA 96 h después de la infección. Tinción nuclear (azul) y Mtb-E2-Crimson (rojo). Barras de escala, 50 µm. j, Análisis cuantitativo de la replicación de Mtb después de la infección con Mtb WT, ΔesxBA y ΔesxBA:BA. El área de Mtb por célula se calculó como cambio de pliegue, en relación con 2 h después de la infección. Datos representativos de tres experimentos independientes (n = 3 pozos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Šídák. ***P < 0,001; NS, no significativo. k, Imágenes representativas de iPSDM fijas infectadas con Mtb WT, ΔcpsA y ΔcpsA:cpsA 96 h después de la infección. Tinción nuclear (azul) y Mtb-E2-Crimson (rojo). Barras de escala, 50 µm. l, Análisis cuantitativo de la replicación de Mtb después de la infección con Mtb WT, ΔcpsA y ΔcpsA:cpsA. El área de Mtb por célula se calculó como cambio de pliegue, en relación con 2 h después de la infección. Datos representativos de tres experimentos independientes (n = 3 pozos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Šídák **P < 0,002; NS, no significativo.

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A continuación, utilizamos repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) – Cas9 para eliminar ATG7 o ATG14 en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para investigar respuestas de autofagia canónicas y no canónicas a Mtb (Datos extendidos Fig. 1a, d) . Probamos si las respuestas de autofagia se alteraron en ATG7 y ATG14 KO iPSC (denominados ATG7-/- y ATG14-/-). El WT iPSC (denominado ATG7+/+ y ATG14+/+) acumuló LC3B-II en respuesta a la inducción de autofagia canónica por inanición, bloqueo de la degradación del autofagosoma por bafilomicina A1 (BafA1) o inducción de autofagia no canónica por tratamiento con monensina31, mientras que ATG7 KO iPSC tenía niveles indetectables de LC3B-II (datos extendidos Fig. 1b, e). Además, ATG7 KO iPSC mostró acumulación de p62 en todas las condiciones en comparación con WT iPSC (datos extendidos, figura 1b). Como se esperaba, ATG14 KO iPSC mostró mayores niveles de p62 en comparación con WT iPSC, incluso en condiciones de alimentación, y no logró alterar los niveles de LC3B-II en respuesta a la inanición o BafA1 (datos extendidos Fig. 1e). Por el contrario, el tratamiento con monensina condujo a un aumento en los niveles de LC3B-II y niveles indetectables de LC3B-I tanto en WT como en ATG14 KO iPSC (Datos extendidos Fig. 1e). A continuación, probamos si la diferenciación en iPSDM afectó los fenotipos de autofagia de ATG7 KO y ATG14 KO iPSC. Como era de esperar, ATG7 KO iPSDM mostró un procesamiento defectuoso de LC3B y un aumento de los niveles de p62 en condiciones de reposo (Datos ampliados, Fig. 1c). Funcionalmente, el ATG14 KO iPSDM no mostró cambios sustanciales en el procesamiento de LC3B después de la inanición o el tratamiento con BafA1 (Datos extendidos Fig. 1f). La inducción de autofagia no canónica con monensina aumentó el procesamiento de LC3B tanto en WT como en ATG14 KO iPSDM, y los niveles de p62 se mantuvieron prácticamente sin cambios en todas las condiciones probadas (Datos extendidos, Fig. 1f). A continuación, los clones de iPSDM se caracterizaron mediante citometría de flujo para la expresión superficial de marcadores de macrófagos. Después de la diferenciación inducida por M-CSF, todos los iPSDM mostraron una reducción en CD14 y un aumento en los niveles de expresión de superficie de CD11b como se muestra antes22,32 (Datos extendidos Fig. 2). Tras la diferenciación, la expresión superficial de ATG7 y ATG14 KO iPSDM de CD163 y CD206 fue similar a WT iPSDM, mientras que los niveles de CD169 fueron más altos tanto en ATG7 como en ATG14 KO iPSDM (datos extendidos, figura 2).

Luego infectamos ATG7 KO iPSDM con Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA que expresan E2-Crimson y analizamos la replicación bacteriana mediante imágenes de alto contenido de una sola célula. La señal de Mtb por macrófago aumentó aproximadamente tres veces en ATG7 KO iPSDM versus dos veces en comparación con WT iPSDM después de 96 h de infección (Fig. 2a, b). Estas diferencias no se debieron a un cambio en la absorción o diseminación bacteriana en ATG7 KO iPSDM, ya que el área bacteriana por célula en la absorción y el porcentaje de células infectadas en todos los puntos de tiempo fueron similares en ambos antecedentes genéticos (Datos extendidos Fig. 3a, b). El aumento en la replicación bacteriana se observó solo durante la infección con Mtb WT, ya que tanto los mutantes Mtb ΔesxBA como ΔcpsA estaban restringidos en ATG7 KO iPSDM (Fig. 2c-f). Como era de esperar, después de la infección de ATG7 KO iPSDM con Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA, no hubo inducción del procesamiento de LC3B (Datos extendidos Fig. 3c). Los niveles de p62 en ATG7 KO iPSDM fueron más altos para Mtb WT y ΔcpsA en comparación con WT iPSDM, posiblemente debido a la regulación positiva transcripcional (Datos extendidos Fig. 3c). La restricción de Mtb ΔcpsA en iPSDM no se asoció con la localización de NADPH oxidasa ya que no se observaron diferencias en el reclutamiento de p40 Phox a Mtb WT y ΔcpsA después de 2 h de infección (Datos extendidos Fig. 4). Sin embargo, a las 48 h después de la infección, los niveles de asociación de p40 Phox con Mtb ΔcpsA fueron más altos en comparación con Mtb WT en iPSDM infectados. Durante el análisis, notamos que en el ATG7 KO iPSDM infectado con Mtb WT había una reducción en el número total de células analizadas mediante imágenes de alto contenido que sugerían muerte celular, un proceso asociado con la replicación de Mtb en macrófagos derivados de monocitos humanos (MDM )14. Para probar esto, tiñemos las células infectadas con NucGreen que tiñe selectivamente las células con integridad comprometida de la membrana plasmática33. El porcentaje de células muertas en ATG7 KO iPSDM fue significativamente mayor después de la infección con Mtb WT, lo que indica que, en las células ATG7 KO, la infección se asoció con la muerte de células de macrófagos (Fig. 2g, h).

a, c, e, Instantánea de ATG7+/+ y ATG7-/- iPSDM vivos infectados con Mtb WT (a), ΔesxBA (c) y ΔcpsA (e) a las 96 h. Tinción nuclear (azul) y Mtb-E2-Crimson (rojo). Barras de escala, 50 µm. b, d, f, análisis cuantitativo de alto contenido de la replicación de Mtb después de la infección de ATG7+/+ o ATG7-/- iPSDM con Mtb WT (b), ΔesxBA (d) y ΔcpsA (f). El área de Mtb por célula se calculó como cambio de pliegue, en relación con 2 h después de la infección. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem. Se usó una prueba t de dos colas no pareada para las comparaciones **P < 0,002; NS, no significativo. g, Imágenes representativas de ATG7+/+ y ATG7-/- iPSDM teñidos con azul/verde (vivo/muerto) no infectados (CTRL) o infectados con Mtb WT durante 96 h. Tinción nuclear (azul) y tinción nuclear muerta (verde). Barras de escala, 50 µm. h, análisis cuantitativo del porcentaje de células positivas para NucGreen en cada condición. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Šídák ***P < 0,001, *P < 0,033; NS, no significativo.

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Para comprender la contribución de ATG14 en la restricción de Mtb, infectamos WT y ATG14 KO iPSDM durante hasta 96 h con Mtb WT, ΔcpsA o ΔesxBA y analizamos la replicación bacteriana mediante imágenes de alto contenido. La replicación de Mtb WT mejoró significativamente en ATG14 KO iPSDM en comparación con WT iPSDM a las 96 h (Fig. 3a, b). De manera similar al ATG7 KO iPSDM infectado con Mtb WT, la mayoría de los ATG14 KO iPSDM sufrieron muerte celular después de la infección con Mtb WT, lo que impidió el análisis basado en imágenes de células fijas. Sin embargo, en comparación con los macrófagos ATG7 KO, el fenotipo de replicación y muerte celular en iPSDM que carece de ATG14 fue más pronunciado a las 96 h después de la infección (30 % ATG7 KO versus 50 % en ATG14 KO muerte celular después de 96 h de infección). Este aumento en la replicación de Mtb no estuvo relacionado con las diferencias en la fagocitosis o el área bacteriana por célula después de la absorción, ya que ambos parámetros fueron similares en ambos antecedentes genéticos (Datos extendidos, Fig. 5a, b). En contraste con iPSDM que carece de ATG7, el mutante Mtb ΔesxBA también se replicó de manera más eficiente en ATG14 KO iPSDM (Fig. 3c, d). A diferencia de Mtb ΔesxBA, el mutante ΔcpsA todavía estaba restringido en ATG14 KO iPSDM (Fig. 3e, f). Tanto en células no infectadas como infectadas, ATG14 KO iPSDM mostró niveles más altos de LC3B-II en comparación con WT iPSDM, lo que sugiere un flujo autofágico deteriorado (Datos extendidos Fig. 5c) Los niveles de p62 en ATG14 KO iPSDM también fueron más altos en comparación con WT iPSDM en todas las condiciones probado, lo que respalda la observación previa con LC3B-II (datos extendidos Fig. 5c). El aumento en la replicación de Mtb WT se asoció con un aumento en el número de células muertas en ATG14 KO iPSDM, medido por tinción con NucGreen, lo que indica que la replicación bacteriana mejorada resultó en la muerte de células de macrófagos. Por el contrario, el fenotipo de muerte celular mejorado no se observó ni en Mtb ΔesxBA ni en ΔcpsA ATG14 KO iPSDM infectado (Fig. 3g, h).

a,c,e, Instantánea de ATG14+/+ y ATG14-/- iPSDM vivos infectados con Mtb WT (a), ΔesxBA (c) y ΔcpsA (e) a las 96 h. Tinción nuclear (azul) y Mtb-E2-Crimson (rojo). Barras de escala, 50 µm. b, d, f, análisis cuantitativo de alto contenido de la replicación de Mtb después de la infección de ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM con Mtb WT (b), ΔesxBA (d) y ΔcpsA (f). El área de Mtb por célula se calculó como cambio de pliegue, en relación con 2 h después de la infección. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem. Se usó una prueba t de dos colas no pareada para las comparaciones **P < 0,002, *P < 0,033; NS, no significativo. g, Imágenes representativas de ATG14+/+ y ATG14-/- iPSDM teñidos con azul/verde (vivo/muerto) no infectados (CTRL) o infectados con Mtb WT, ΔesxBA y ΔcpsA durante 96 h. Tinción nuclear (azul) y tinción nuclear muerta (verde). Barras de escala, 50 µm. h, Análisis cuantitativo del porcentaje de células positivas NucGreen en cada condición. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem ANOVA bidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002. Barras de escala, 50 µm.

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Para definir si los ATG14 KO iPSDM estaban muriendo debido a la alta carga bacteriana o si se volvieron más permisivos para la replicación de Mtb después de que sufrieron la muerte celular, realizamos imágenes de células vivas de alto contenido de iPSDM infectadas con Mtb WT en presencia de yoduro de propidio (PI ), una sonda para la pérdida de integridad de la membrana plasmática14. De manera similar a lo que observamos a las 96 h después de la infección (Fig. 3g, h), la proporción de iPSDM positivo para PI que carecen de ATG14 fue seis veces mayor que en WT iPSDM (Fig. 4a-d y Película complementaria 1). La muerte celular aumentó exponencialmente después de 72 h de infección en ATG14 KO iPSDM, lo que se correlacionó con altas cargas bacterianas (Fig. 4c, d y Película complementaria 1). Si bien la replicación de Mtb fue mayor en ATG14 KO iPSDM a partir de las 48 h, el aumento en la muerte celular solo se observó a partir de las 72 h, lo que sugiere que la replicación mejorada de Mtb precede a la muerte celular. Observamos que la mayoría de los macrófagos deficientes en ATG14 con alta carga bacteriana perdieron la integridad de su membrana plasmática y se volvieron positivos para PI. La replicación bacteriana continuó después de que las células presentaran fugas, y la mayoría de las células con mayor carga bacteriana se vieron comprometidas. El análisis cuantitativo de la replicación bacteriana capturó una diferencia pronunciada entre WT y ATG14 KO iPSDM. El cambio de veces en la replicación bacteriana fue de ocho veces en ATG14 KO iPSDM en comparación con cuatro veces para WT iPSDM (Fig. 4a, c). Esto mostró que el cambio de pliegue se subestimó con el enfoque de instantánea en vivo debido a la pérdida de células muy infectadas durante el paso de tinción de viabilidad. Para validar nuestros hallazgos, nos dirigimos a ATG7 y ATG14 en MDM humana usando CRISPR-Cas9 como un complejo de ribonucleoproteína (RNP) que consta de proteína Cas9 y ARN guía único (sgRNA) por nucleofección34 (Fig. 4e, f). Después de la infección de MDM, hubo tasas de replicación más altas con Mtb WT (2,6 veces) y ΔesxBA (0,3 veces) en MDM sin ATG14 (Fig. 4g) que en WT (Fig. 4h) o MDM deficiente en ATG7 (Fig. .4i). El grupo KO de ATG7 en MDM mostró una mayor replicación de Mtb WT (1.1 veces) después de 5 días de infección en comparación con WT MDM (0.6 veces) (Fig. 4g, i); sin embargo, este aumento no se observó para Mtb ΔesxBA.

a, c, análisis cuantitativo de alto contenido de la replicación de Mtb WT en vivo en ATG14+/+ (a) o ATG14-/- (c) iPSDM. El área de Mtb (diagrama de puntos) y la muerte celular (diagrama de barras) se calcularon como cambio de pliegue, en relación con la captación de Mtb en el tiempo 0 h después de la infección. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes. b, d, Micrografías representativas en los puntos de tiempo indicados de ATG14+/+ (b) o ATG14-/- (d) iPSDM infectado con Mtb WT (verde) en presencia de PI (rojo). Datos representativos de uno de dos experimentos independientes. Barras de escala, 50 µm. e, f, Western blot de grupo MDM humano-KO para ATG14 (e) o ATG7 (f). Datos representativos de uno de dos experimentos independientes. g, análisis cuantitativo de alto contenido de Mtb WT vivo y replicación ΔesxBA en MDM humano. El área de Mtb (diagrama de puntos) se calculó como cambio de veces, en relación con la absorción de Mtb en el tiempo 0 h después de la infección. h, i, análisis cuantitativo de alto contenido de la replicación de Mtb WT y Mtb ΔesxBA vivos en pool-KO de MDM humano nucleofectado para ATG14 (h) o ATG7 (i). El área de Mtb (diagrama de puntos) se calculó como cambio de veces, en relación con la absorción de Mtb en el tiempo 0 h después de la infección. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes.

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A continuación, nos centramos en comprender si el aumento de la replicación de Mtb WT se debió a un acceso citosólico mejorado. Para probar esto, usamos Galectin-3 (Gal3) como marcador, que se sabe que reconoce los glicanos luminales de las membranas fagosómicas dañadas. El porcentaje de Mtb WT asociado a Gal3 en ATG7 KO iPSDM no fue diferente de WT iPSDM (Datos extendidos Fig. 6a, b). Se observó una asociación clara de Gal3 con Mtb WT y ΔcpsA tanto en WT como en ATG7 KO iPSDM, mientras que para Mtb ΔesxBA estuvo casi ausente (Datos extendidos Fig. 6a, b). El porcentaje de fagosomas positivos para Gal3 que contenían Mtb WT y ΔcpsA fue mayor a las 2 h después de la infección en iPSDM deficiente para ATG14 en comparación con WT iPSDM (Fig. 5a, b). Este efecto se observó en las primeras etapas de la infección, lo que sugiere que ATG14 regula el acceso temprano de Mtb al citosol. Como se esperaba, los niveles de Mtb ΔesxBA positivo para Gal3 fueron más bajos tanto en WT como en ATG14 KO iPSDM y no hubo diferencias entre los genotipos de iPSDM para ΔcpsA en tiempos posteriores a la infección (Fig. 5a, b). Luego analizamos la generación de LC3-TVS, que son una consecuencia del daño de membrana inducido por Mtb22. De acuerdo con los resultados de la asociación Gal3, el porcentaje de Mtb WT positivo para LC3-TVS fue significativamente mayor en ATG14 KO iPSDM, lo que sugiere que la proporción de fagosomas Mtb dañados fue mayor (Fig. 5c). Como era de esperar, este efecto también se observó con el mutante Mtb ΔcpsA pero no en las células infectadas con Mtb ΔesxBA, lo que confirma el papel del sistema de secreción ESX-1 (Fig. 5c). No hubo diferencias en el reclutamiento de LC3B a Mtb en estas células (Fig. 5d). Para confirmar estas observaciones a nivel ultraestructural, analizamos la localización bacteriana mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). El análisis estereológico de las bacterias citosólicas confirmó además que una fracción más alta de Mtb WT se localizó en el citosol de iPSDM deficiente en ATG14 48 h después de la infección (Fig. 5e). En los macrófagos WT y ATG14 KO, la gran mayoría de ΔesxBA se localizaron en los fagosomas. Sin embargo, a diferencia de las células WT, en ATG14 iPSDM una pequeña fracción de ΔesxBA estaba en el citosol, lo que probablemente se debió a la combinación de altos niveles de bacterias y el efecto informado de PDIM en el daño de la membrana del fagosoma17,18,35,36.

a, tinción de GAL3 en ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM infectado con Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA. Tinción nuclear (azul), GAL3 (verde) y Mtb E2-Crimson (rojo). Barras de escala, 10 µm. b. Datos recopilados de tres experimentos independientes. Los resultados se muestran como media ± sem ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002; NS, no significativo. c, d, tinción LC3B (arriba) y cuantificación (abajo) de iPSDM ATG14+/+ o ATG14-/- infectados con Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA, 2 h después de la infección. Mtb en compartimentos TVS-LC3B-positivo (c) o LC3B-positivo (d). Tinción nuclear (azul), LC3B (verde) y Mtb E2-Crimson (rojo). Barras de escala, 10 µm. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 5 campos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002; NS, no significativo. e, Micrografías electrónicas de transmisión de Mtb WT o ΔesxBA en distintas ubicaciones subcelulares en ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM después de 48 h de infección (izquierda) y cuantificación estereológica de la distribución subcelular de Mtb WT y ΔesxBA a partir de imágenes TEM (derecha) . Datos recopilados de dos experimentos independientes. Barras de escala, 500 nm.

Datos fuente

Los resultados anteriores proporcionaron una explicación del comportamiento altamente permisivo de ATG14 KO iPSDM a Mtb WT. Sin embargo, la mayor tasa de replicación de Mtb ΔesxBA, que no puede acceder de manera eficiente al citosol, fue inesperada. Además, los resultados de TEM sugirieron un entorno intrafagosómico permisivo para la replicación de Mtb ΔesxBA. Para investigar esto más a fondo, analizamos Mtb que están asociados a la sonda de orgánulo ácido LysoTracker (LTR) durante la infección y cuantificamos la intensidad media de LTR como una medida de la maduración del fagosoma. Después de 2 h de infección, la intensidad media de LTR fue menor tanto para Mtb WT como para ΔesxBA en iPSDM infectado con ATG14 KO (Fig. 6a, b). La asociación LTR permaneció más baja para Mtb WT y ΔesxBA en ATG14 KO iPSDM incluso después de 24 h de infección (Fig. 6a, b). De acuerdo con los resultados de replicación en ATG7 KO iPSDM, no observamos diferencias significativas en la intensidad de LTR asociada a Mtb WT o ΔesxBA en WT versus ATG7 KO iPSDM (Datos extendidos Fig. 6c, d). Dado que Mtb ΔesxBA se encuentra principalmente en los fagosomas, estos resultados sugirieron que se requiere ATG14 para la maduración de los fagosomas de Mtb. Para confirmar estas observaciones, generamos una cepa informadora dual que responde al pH y la concentración de cloruro del ambiente (rv2390::mWasabi,pMSP12::E2Crimson)37. El reportero contiene el promotor constitutivo pMSP12 que impulsa la expresión de E2-Crimson y el promotor de rv2390 que impulsa la expresión de mWasabi en respuesta al aumento de las concentraciones de cloruro [Cl−] y la disminución del pH en el fagosoma, que son indicadores de la maduración del fagosoma37. Cuando se analizó la proporción de mWasabi/E2-Crimson en iPSDM infectado, encontramos que la actividad del promotor que respondía al pH y al cloruro aumentó significativamente hasta 48 h (Fig. 6c, d) como se informó anteriormente en macrófagos de ratón37. Por el contrario, en ATG14 KO iPSDM, la actividad del promotor permaneció baja incluso después de 48 h de infección (Fig. 6c, d). La inhibición de la acidificación dependiente de V-ATPasa de los fagosomas de Mtb con bafilomicina A1 (BAF) perjudicó la actividad del promotor rv2390 tanto en WT como en ATG14 KO iPSDM (Fig. 6c, d).

a, Instantánea de ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM vivos infectados con Mtb WT y ΔesxBA teñidos con LTR y colorante NucBlue. Tinción nuclear (azul), LTR (verde) y Mtb E2-Crimson (rojo). Barras de escala, 10 µm. b, Análisis cuantitativo de la asociación LTR con Mtb como intensidad de fluorescencia media (MFI). Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002, *P < 0,033. c, Instantánea de ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM infectado con Mtb que expresa rv2390::mWasabi,pMSP12::E2-Crimson reporter en presencia o ausencia de BafA1 (BAF). Barras de escala. 10 micras. d, Análisis cuantitativo de la actividad del promotor rv2390 como MFI de mWasabi sobre E2-Crimson en los puntos de tiempo indicados de infección con ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM. Datos representativos de uno de tres experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Šídák ***P < 0,001, **P < 0,002; NS, no significativo. e, Instantánea de ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM infectado con cepas Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA que expresan rv2390::mWasabi, pMSP12::E2-Crimson reporter a las 48 h de la infección. Barras de escala, 10 µm. f, Análisis cuantitativo de la actividad del promotor rv2390 como MFI de mWasabi sobre E2-Crimson en cepas Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA en los puntos de tiempo indicados de infección con ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± sem ANOVA bidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. ***P < 0,001; NS, no significativo.

Datos fuente

Luego transformamos las cepas Mtb ΔesxBA y ΔcpsA con el mismo reportero e infectamos iPSDM. Después de la infección de WT iPSDM, la actividad del promotor en Mtb ΔesxBA fue significativamente mayor que en Mtb WT (Fig. 6e, f). Por el contrario, la actividad del indicador Mtb ΔesxBA rv2390::mWasabi se redujo sustancialmente en ATG14 KO iPSDM (Fig. 6e, f). Similar a Mtb WT, la actividad del indicador rv2390::mWasabi en Mtb ΔcpsA también se redujo en ATG14 KO iPSDM ya que tanto Mtb WT como ΔcpsA estaban menos expuestos a un pH bajo y [Cl−] en comparación con Mtb ΔesxBA (Fig. 6e,f ). El tratamiento con BAF redujo la actividad del indicador rv2390::mWasabi en todas las condiciones probadas, lo que confirma que la actividad del indicador dependía del pH (datos extendidos, Fig. 6e,f).

Usando una combinación de enfoques genéticos y de imágenes, mostramos que los macrófagos humanos deficientes en autofagia tienen defectos cruciales en el control de Mtb. Nuestro modelo de macrófagos humanos proporciona una herramienta para examinar la función de la autofagia durante la infección por Mtb. Se ha informado que la interrupción de la vía de la autofagia por enfoques de eliminación de genes aumenta significativamente la replicación de Mtb en macrófagos de ratón in vitro23,24,25, y los datos presentados en este artículo proporcionan evidencia genética de que, al menos para ATG7 y ATG14, esto también es el caso de los macrófagos humanos.

De las seis proteínas Atg estudiadas en modelos de ratón, solo Atg5 tiene un efecto sustancial en la infección por Mtb WT in vivo, medida por las unidades formadoras de colonias, la inflamación y la supervivencia26,38. Sin embargo, la patología observada in vivo se debe principalmente al aumento de la inflamación neutrofílica ya una función independiente de la autofagia de Atg5, a través de un mecanismo no explicado26,38. Uno de los argumentos para explicar estos resultados contradictorios hasta el momento es que, in vitro, las diferencias en la replicación no son grandes y, por lo tanto, no se traducen directamente en entornos in vivo. Aunque no está claro si un gran número de bacterias en los tejidos son relevantes en el contexto de la TB39 humana, en nuestros experimentos con macrófagos humanos que carecen de los genes de autofagia ATG7 y ATG14, observamos que las células eran altamente permisivas a Mtb y se asociaban con una extensa necrosis celular. muerte. Los macrófagos de ratón producen altos niveles de óxido nítrico (NO) en los pulmones, que es fundamental para el control de la TB in vivo40, y los altos niveles de NO podrían enmascarar algunos de los efectos dependientes de la autofagia. Además, los sistemas de recombinación Cre-lox utilizados en ratones para KO condicionales no son 100 % eficientes y podría haber algo de autofagia residual41. Es importante destacar que existe un buen equilibrio entre la autofagia y la muerte celular en diferentes contextos y la eliminación condicional in vivo de genes críticos de autofagia en tipos de células específicos podría afectar la supervivencia de estas células in vivo y, específicamente, agotar las poblaciones celulares. Hasta ahora, los modelos in vivo utilizados para estudiar la autofagia han sido en ratones C57BL/6 resistentes a la TB, y sería importante investigar el papel de la autofagia en cepas de ratones susceptibles a la TB como los ratones C3H/HeBFeJ42 o B6.Sst1S43 que muestran lesiones necróticas que se asemejan más a la TB humana.

Nuestros datos muestran que la restricción e inducción de la muerte celular dependiente de ATG7 y ATG14 se asocia principalmente con la infección por Mtb WT. Nuestros datos respaldan la idea de que tanto ATG7 como ATG14 controlan la replicación de bacterias citosólicas mediante la recuperación de bacterias del citosol22 o el sellado de fagosomas dañados por autofagosomas como se informó para Salmonella44. El mutante Mtb ΔcpsA es capaz de dañar la membrana del fagosoma, pero es posible que la atenuación ocurra en pasos anteriores de la infección o que el mutante Mtb ΔcpsA no pueda replicarse eficientemente en el citosol debido a defectos desconocidos, por ejemplo, en la adquisición de nutrientes. .

Nuestros experimentos genéticos de KO sugieren que no se requiere autofagia canónica ni no canónica para el control del mutante Mtb ΔcpsA en macrófagos humanos. Los macrófagos de ratón Atg7 KO no pudieron restringir Mtb ΔcpsA hasta 72 h después de la infección12. Sin embargo, en iPSDM, Mtb ΔcpsA mostró una replicación atenuada tanto en ATG7 KO, que son deficientes en la autofagia tanto canónica como no canónica, y en los macrófagos ATG14 KO, que están deteriorados para la autofagia canónica pero no no canónica. En los macrófagos de ratón, se ha demostrado que la atenuación del mutante Mtb CpsA KO se debe al aumento del reclutamiento de NADPH oxidasa y la producción de ROS fagosomal que conduce a LAP. A diferencia de los resultados en macrófagos de ratón primarios, en iPSDM Mtb ΔcpsA reclutó NADPH oxidasa a niveles similares a Mtb WT 2 h después de la infección. Esta discrepancia podría deberse a las diferencias entre los macrófagos humanos y de ratón, los protocolos de diferenciación y los antecedentes genéticos de las cepas parentales de Mtb utilizadas. Todas las cepas utilizadas en este estudio se derivan de la misma cepa parental y se analizaron para determinar el estado de PDIM, lo que nos permite comparar directamente los resultados fenotípicos durante la infección. En este contexto, se requieren más estudios y la caracterización de su localización para definir el mecanismo preciso por el cual el mutante Mtb ΔcpsA se restringe en los macrófagos humanos.

Proponemos que ATG7 y ATG14 actúen en diferentes etapas del estilo de vida intracelular de Mtb en macrófagos humanos. Mientras que los macrófagos ATG7 KO mostraron un cambio significativo en la replicación de Mtb WT y la muerte celular inducida por Mtb, el KO de ATG14, que interrumpe solo la autofagia canónica pero deja intacta la autofagia no canónica, condujo a un aumento más pronunciado de la replicación de Mtb WT y el mutante. Mtb ΔesxBA. Hay evidencia de que ATG14 regula la fusión entre autofagosomas y lisosomas45 y también tiene una función en la vía endosomal que es independiente de la autofagia46. Descubrimos que ATG14 también regula la fusión entre los fagosomas y los lisosomas que contienen Mtb en los macrófagos, pero los mecanismos que regulan este proceso deben investigarse más a fondo. Nuestros resultados plantean preguntas sobre los posibles vínculos entre la maduración del fagosoma y el acceso citosólico como se muestra en Dyctiostelium21. ¿Es una disminución en la maduración del fagosoma el resultado de un mayor daño a la membrana? ¿O es que la maduración reducida del fagosoma conduce a un mayor daño de la membrana y un mayor acceso al citosol? Estudios posteriores definirán cómo se regulan temporalmente estos eventos.

En conjunto, nuestros datos revelaron que ATG7 y ATG14 son necesarios para controlar la infección de Mtb por macrófagos, lo que demuestra que las proteínas de autofagia regulan diferentes etapas: ATG7 y ATG14 regulan el control de Mtb citosólico y ATG14 además de la fusión de fagosomas de Mtb con lisosomas. Comprender cómo actúa la autofagia para controlar la infección de patógenos intracelulares en humanos permitirá el desarrollo de terapias dirigidas al huésped.

Mtb H37Rv (Mtb WT) fue proporcionado por el Prof. Douglas Young (The Francis Crick Institute, Reino Unido). Los mutantes de deleción de Mtb para cpsA (rv3484) o esxB y esxA (rv3874 y rv3875) se construyeron usando ORBIT47. Para cada mutante, los transformantes se verificaron mediante PCR (Tabla complementaria 1) y se confirmaron mediante la secuenciación del genoma completo. La complementación de la deleción del gen cpsA se realizó mediante la expresión del gen cpsA de Mtb H37Rv bajo el control del promotor hsp60 del sitio MS6 en el cromosoma. La complementación de la eliminación de los genes esxBA se logró colocando la expresión de Mtb H37Rv esxB y esxA bajo el control del promotor Psmyc30 del sitio MS6 en el cromosoma. Se diseñaron cepas fluorescentes para expresar E2-Crimson de pTEC19 (Addgene #30178, de la Prof. Lalita Ramakrishnan). Las cepas indicadoras duales de Mtb se construyeron a través de la expresión episomal de E2-Crimson del mismo promotor constitutivo que en pTEC19 y el gen mWasabi amplificado del vector pTEC15 (Addgene #30174, de la Prof. Lalita Ramakrishnan) se colocó bajo el control del cloruro. - y promotor rv2390c ​​sensible a pH bajo37,48. Las cepas de Mtb se cultivaron en Middlebrook 7H9 (Sigma-Aldrich, M0178) complementado con 0,2 % de glicerol (Fisher Chemical, G/0650/17), 0,05 % de Tween-80 (Sigma-Aldrich, P1754) y 10 % de ADC (BD Biosciences, 212352). Se usaron marcadores de selección apropiados 50 µg ml−1 de higromicina (Invitrogen, 10687010), 25 µg ml−1 de kanamicina (Sigma-Aldrich, K1876) o 25 µg ml−1 de zeocina (Invivogen, ant-zn-05) cuando fue necesario.

Treinta mililitros de cultivo de micobacterias en fase logarítmica se centrifugaron durante 5 min a 2000 g a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se filtró dos veces con un filtro de 0,22 µm. El sedimento se lavó con tampón de lavado (PBS-Tween-80 0,05% o PBS-Tyloxapol 0,05%), luego con PBS. El sedimento se resuspendió en 500 µl de PBS que contenía inhibidor de proteasa y se transfirió a un tubo con tapón de rosca de 2 ml, 1/3 lleno de perlas de vidrio (Sigma, G-1145). Las muestras se ribolizaron en el ajuste 6,5 durante 30 s, luego se colocaron en hielo durante 5 min y se centrifugaron dos veces a 4000 g durante 1 min a 4 °C. El sobrenadante restante se centrifugó a 4000 g durante 10 min a 4 °C y se transfirieron 500 μl a un dispositivo de filtro centrífugo Millipore Ultrafree-MC. Las muestras se filtraron dos veces con un dispositivo de filtro centrífugo Millipore Ultrafree-MC a 4000 g durante 5 min a 4 °C.

Las iPSC humanas EIKA2 y KOLF2 se obtuvieron de Public Health England Culture Collections (números de catálogo 77650059 y 77650100, respectivamente) y se mantuvieron en placas recubiertas con vitronectina XF (StemCell Technologies, 100–0763) con medio Essential 8 (Gibco, A1517001). Las células se autenticaron mediante perfiles STR y se comprobaron mensualmente para detectar contaminación por Mycoplasma. Las células se pasaron utilizando Versene (Gibco, 15040066). Las fábricas de monocitos se establecieron siguiendo un protocolo previamente informado32. Los cuerpos embrionarios (EB) se alimentaron diariamente con dos cambios de medio al 50 % con E8 suplementado con 50 ng ml−1 hBMP4 (Peprotech, 120-05), 50 ng ml−1 hVEGF (Peprotech, 100-20) y 20 ng ml −1 hSCF (Peprotech, 300-07) durante 3 días. En el día 4, los EB se recolectaron y sembraron a 100-150 EB por matraz T175 o 250-300 por matraz T225 en medio de fábrica XVIVO o medio de fábrica OXM (Tabla complementaria 2). Estas fábricas de monocitos se alimentaron semanalmente durante 5 semanas hasta que se observaron monocitos en el sobrenadante. Semanalmente se recogió hasta el 50 % del sobrenadante y se centrifugó a 300 g durante 5 min. Las células se resuspendieron en medio de diferenciación XVIVO o medio de diferenciación OXM (Tabla complementaria 2). Los monocitos se colocaron en placas a 4 × 106 células por placa de Petri de 10 cm para diferenciarlos durante 7 días; el día 4 se realizó un cambio de medio del 50%. Para separarlas, las células se lavaron una vez con PBS (pH 7,4), luego se incubaron con Versene durante 15 min a 37 °C y 5 % de CO2 antes de diluir 1:3 con PBS y raspar suavemente. Los macrófagos se centrifugaron a 300 gy se colocaron en placas para los experimentos.

Se inactivaron diez mililitros de cultivo logarítmico durante 2 h a 95 °C en 1 ml de PBS. Después de tres lavados en agua, los sobrenadantes de incubaciones sucesivas en cloroformo:metanol (2:1) y metanol:cloroformo (1:1) se juntaron y secaron a 55 °C. Los lípidos secos se resuspendieron en cloroformo, se resolvieron en una placa de gel de sílice con una mezcla de disolventes de éter de petróleo: acetato de etilo (98:2) y se visualizaron con ácido fosfomolíbdico al 5 % en etanol frente a PDIM purificados (H37Rv, Phthiocerol Dimycocerosate purificado, BEI Resources, NR-20328) y una cepa defectuosa en la síntesis de PDIM49 como controles positivo y negativo, respectivamente.

La estrategia KO basada en CRISPR-Cas9 utilizó cuatro sgRNA que flanqueaban exones de genes específicos para obtener una eliminación de una secuencia genómica. Los sgRNA dirigidos a ATG7 y ATG14 se diseñaron y seleccionaron utilizando la herramienta de diseño WGE CRISPR (www.sanger.ac.uk/htgt/wge/)50. La nucleofección de las iPSC EIKA2 se realizó utilizando Amaxa 4D-Nucleofector (V4XP-3024, Lonza) para obtener clones ATG7 KO. ATG7 KO iPSC eran viables y no mostraron deficiencia de replicación, aunque los pasos de formación de EB y producción de monocitos fueron variables. Para cada nucleofección, se resuspendieron 1 × 106 de iPSC humanas en 100 µl de tampón P3 (Lonza, V4XP-3024) que contenía 20 µg de Sp Cas9 (Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3, 1081059, IDT) mezclado con un total de 16 µg de ARN de guía única modificados químicamente sintéticos (Synthego) (Tabla complementaria 3). Las células y la mezcla Cas9-RNP fueron luego nucleofectadas con el programa CA-137. Después de la nucleofección, los clones individuales se seleccionaron manualmente 51 y se examinaron mediante un ensayo basado en PCR (para conocer las secuencias, consulte la Tabla complementaria 1). La nucleofección de iPSC KOLF2 para obtener clones ATG14 KO y ATG7 KO se realizó como se indicó anteriormente.

Las células se recogieron y se incubaron en PBS/BSA al 0,1 % (Cell Signaling Technologies, 9998S) y 5 µl de bloque Fc por millón de células durante 20 min. Cincuenta microlitros de células se incubaron con 50 µl de cóctel de anticuerpos diluidos en PBS/BSA al 0,1 % durante 20 min en hielo en la oscuridad. Las células se lavaron en 2 ml de PBS y se fijaron en paraformaldehído al 2% (PFA; Electron Microscopy Sciences, 15710). Las células se analizaron en un citómetro de flujo LSRII. Los anticuerpos se compraron de BD Biosciences y se detallan en la Tabla complementaria 4. Los datos de citometría de flujo se analizaron y trazaron en FlowJo (BD Biosciences).

iPSDM se sembraron a una densidad de 50 000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos, 150 000 células por pocillo de una placa de 24 pocillos, 500 000 células por pocillo de una placa de 12 pocillos y 1 × 106 células por pocillo de una placa de 6 pocillos. buen plato. Los cultivos bacterianos de fase logarítmica media (OD600 0,5–1,0) se centrifugaron a 2000 g durante 5 min y se lavaron dos veces en PBS. Luego, los sedimentos se agitaron vigorosamente durante 1 min con perlas de vidrio de 2,5–3,5 mm (VWR, 332124 G) y las bacterias se resuspendieron en 10 ml de medio de cultivo de macrófagos antes de centrifugarlas a 300 g durante 5 min para eliminar los grumos grandes. Se tomaron los 7 ml superiores de la suspensión bacteriana, se registró la DO600 y la suspensión se diluyó adecuadamente para la infección. Después de 2 h de captación, las bacterias extracelulares se eliminaron con dos lavados en PBS y los macrófagos se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2. En el momento requerido después de la infección, las células se recogieron o se fijaron en PFA al 4%. Se utilizó una multiplicidad objetivo de infección (MOI) de 1 para todos los experimentos, asumiendo que OD600 de 1 es 1 × 108 bacterias ml−1. El tratamiento con bafilomicina A1 se realizó en paralelo a la infección con una concentración final de 100 nM y se mantuvo presente hasta el último momento.

Las células se prepararon a partir de conos de leucocitos (NC24) suministrados por el Servicio de Sangre y Trasplantes del NHS14. Los glóbulos blancos se aislaron por centrifugación en Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare, 17-5442-03) durante 60 min a 300 g. Se recogieron células mononucleares y se lavaron dos veces con solución de lavado MACS (Miltenyi, 130-091-222) para eliminar plaquetas y glóbulos rojos. Las muestras restantes se incubaron con 10 ml de tampón de lisis de RBC (Sigma, R7757) por sedimento durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron con tampón de lavado y se resuspendieron en 80 µl de solución de lavado MACS suplementada con BSA al 1 % (Miltenyi, 130-091-376) (MACS/BSA) y 20 µl de perlas magnéticas anti-CD14 (Miltenyi, 130-050-201). ) por 108 celdas. Después de 20 min en hielo, las células se lavaron en solución MACS/BSA y se resuspendieron a una concentración de 108 células por 500 µl en solución MACS/BSA y luego se pasaron a través de una columna LS (Miltenyi, 130-042-401) en el campo de un imán separador QuadroMACS (Miltenyi, 130-090-976). La columna LS se lavó tres veces con solución MACS/BSA, luego las células positivas para CD14 se eluyeron, centrifugaron y resuspendieron en RPMI 1640 completo con GlutaMAX y HEPES (Gibco, 72400-02) y suero fetal bovino al 10 % (FBS; Sigma, F7524).

Las células se lavaron dos veces con PBS y se sometieron a electroporación en la solución de nucleofección primaria apropiada (Kit de Nucleofector de monocitos humanos Amaxa, n.º de cat. VPA-1007) usando el Nucleofector Lonza 2b (Dispositivo Nucleofector 2b, AAB-1001). Se utilizó un total de 5 × 106 de células por reacción y se resuspendió en 100 µl de solución de nucleofección primaria que contenía 4 µg de Sp Cas9 (IDT) mezclado con un total de 12 µg de ARN de guía única modificados químicamente sintéticos dirigidos (Synthego) (Suplementario Tabla 3). Luego, los MDM se nucleofectaron con el grupo de sgRNA y la mezcla Cas9-RNP utilizando el programa Y001. Las células nucleofectadas se cultivaron en RPMI 1640 precalentado complementado con GlutaMAX, HEPES y FBS al 10 % en una placa de seis pocillos. Dos horas después de la nucleofección, se añadieron a las células 100 ng ml−1 hM-CSF. Las placas se incubaron en una incubadora humidificada a 37 °C con 5 % de CO2. Después de 3 días, se añadió un volumen igual de medio completo fresco que incluía 100 ng ml-1 hM-CSF. Después de 6 días, los macrófagos diferenciados se separaron en EDTA 0,5 mM en PBS enfriado con hielo usando raspadores de células (Sarsted, 83.1830), se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en medio RPMI que contenía FBS34 al 10%.

Las células se lavaron una vez con PBS, se lisaron en hielo en tampón RIPA (Millipore, 20-188) que contenía inhibidor de proteasa libre de EDTA completo (Thermo Fisher Scientific, 78445) y se hirvieron a 95–100 °C durante 20 min en muestra LDS ( Thermo Fisher Scientific, NP008) y agente reductor de muestras NuPage (Thermo Fisher Scientific, NP009). Las muestras se cargaron en gel Bis-Tris al 4–12 % (Thermo Fisher Scientific, WG1403BOX) y se realizó electroforesis a 100 V durante 120 min. Los geles se transfirieron a una membrana de PVDF usando un iBlot2 (Thermo Fisher Scientific, IB21001) usando el programa P0. Las membranas se bloquearon en leche desnatada en polvo al 5 % en TBS más Tween20 al 0,05 % (TBS-T) durante 1 h a temperatura ambiente, luego se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Las membranas se lavaron en TBS-T y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se desarrollaron con reactivo de quimioluminiscencia mejorado (Bio-Rad) y se tomaron imágenes en un Amersham GE Imager 680 (GE Healthcare). La escala de peso molecular fue de Abcam (116028).

Las células se lavaron dos veces con PBS, luego se incubaron durante 2 h en medio completo o se privaron de aminoácidos con solución salina equilibrada de Hanks (Thermo Fisher Scientific, 14170088) con o sin bafilomicina A1 100 nM (Merck, B1793-10UG) o 50 µM. monensina (Sigma Aldrich, M5273-5G). Los anticuerpos utilizados fueron p62 (5114), Atg7 (8558), Atg14 (5504 S), β-actina-HRP (12262) de Cell Signaling Technologies, LC3B (ab48394), anti-ESAT6 (EsxA, ab26246), anti-CFP10 ( EsxB, ab45074) y anti-Ag85 (ab36731) de Abcam, y anti-IgG de conejo conjugada con HRP (W4011) y anti-IgG de ratón conjugada con HRP (W4021) de Promega.

Las células se fijaron en PFA al 4 % en PBS, se extinguieron con NH4Cl 50 mM en PBS durante 10 min a temperatura ambiente y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,3 %, FBS al 5 % en PBS durante 30 min. Los anticuerpos se diluyeron en PBS que contenía FBS al 5 % y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Entre los anticuerpos, las células se lavaron tres veces en PBS. Los núcleos se tiñeron durante 10 min con DAPI (ThermoFisher, D1306) diluido 1:10.000 en PBS. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio con medio de montaje DAKO (DAKO, S3023). Los anticuerpos utilizados fueron Alexa Fluor 488 anti-ratón/Mac-2 humano (Galectin-3) (BioLegend, 125410, 1:500), anti-LC3B (MBL, PM036, 1:100), p40 Phox (Millipore, 07– 503, 1:100) y anticonejo-Alexa Fluor 488 (Life Technologies, A11034, 1:500).

Se tomaron imágenes de los cubreobjetos utilizando un microscopio confocal invertido Leica SP8 (Leica Microsystems) con un objetivo de inmersión en aceite de 63 × 1,4 de apertura numérica (NA). La fluorescencia se detectó utilizando detectores HyD. Los ajustes del láser y del detector se mantuvieron constantes entre las condiciones para cada réplica biológica de un experimento.

Después de 72 o 96 h de infección, las células se tiñeron durante 30 min utilizando el kit de imágenes de viabilidad celular Blue/Green ReadyProbes (Invitrogen, R37609) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para obtener imágenes de los puntos de tiempo 2, 24 y 48 h después de la infección, solo se utilizó el reactivo NucBlue ReadyProbes (Thermo Fisher Scientific, R37605). Las imágenes de células vivas se realizaron utilizando un microscopio OPERA Phenix (Perkin Elmer) con un objetivo de inmersión en agua de 40 × 1,1 NA con un 10 % de superposición entre campos adyacentes, tres pozos por condición por experimento. La segmentación y el análisis se realizaron con el software Harmony (Perkin Elmer, versión 4.9) en el que se utilizó la proyección máxima de planos z individuales con una distancia aproximada de 1 µm para realizar la segmentación de una sola célula mediante la combinación de 'Buscar núcleos' y 'Buscar celdas' bloques de construcción. Para cuantificar la replicación de Mtb, el bloque de construcción 'Find Spots' de Harmony detectó bacterias. Para determinar el área de bacterias para cada celda, se sumó el área del punto para cada celda segmentada. El área media de bacterias por celda de cada punto de tiempo y condición se importó a R Studio (The R Project for Statistical Computing, versión 1.3.1073). Luego, los resultados se exportaron como un archivo .csv. El crecimiento de Mtb como cambio de veces se calculó mediante la siguiente fórmula: (área media de Mtb por celda para el punto de tiempo en - área media de Mtb por celda en t2h)/(área media de Mtb por celda en t2h).

Para evaluar la muerte celular, la segmentación y el análisis se realizaron con el software Harmony, donde se usó la proyección máxima de planos z individuales con una distancia aproximada de 1 µm para realizar la segmentación de una sola célula mediante el bloque de construcción 'Buscar núcleos'. Se calculó el número de núcleos totales y luego se calcularon los núcleos que dieron positivo para NucGreen estableciendo un umbral en la intensidad de Alexa Fluor 488. El porcentaje de muerte celular se determinó dividiendo el número de núcleos verdes sobre el número total de núcleos.

Se sembró un total de 50.000 macrófagos por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo de olefina. Las células se infectaron con Mtb a una MOI de 1 durante 2 h. Después de la infección, las células se lavaron con PBS y se reemplazaron con medio que contenía 0,4 µg ml−1 de PI (Abcam, ab14083). La obtención de imágenes se realizó utilizando un microscopio OPERA Phenix (Perkin Elmer) con un objetivo de inmersión en agua de 40 × 1,1 NA con una superposición del 10 % entre los campos adyacentes. Se monitorearon cinco planos con una distancia de 1 µm de más de 20 campos de visión a lo largo del tiempo y se tomaron instantáneas cada 1,5 h durante 96 h. Para evaluar la replicación bacteriana y la muerte celular, el análisis se realizó con el software Harmony donde se utilizó la proyección máxima de planos z individuales con una distancia aproximada de 1 µm. Para realizar la segmentación celular, el bloque de construcción 'Buscar regiones de textura' se entrenó en el canal Brightfield para segmentar áreas celulares. Después de la segmentación del área celular, se usaron los bloques de construcción 'Buscar puntos' y 'Buscar núcleos' para segmentar los núcleos positivos para Mtb y PI. Para determinar el área de bacterias y los núcleos positivos para PI a lo largo del tiempo, se sumaron el área del punto y el número de núcleos positivos para PI para cada punto de tiempo. El crecimiento de Mtb como cambio de veces se calculó mediante la siguiente fórmula: (suma del área de Mtb intracelular para el punto de tiempo - suma del área de Mtb intracelular en t0h)/(suma del área de Mtb intracelular en t0h). La muerte celular como cambio de pliegue se calculó mediante la siguiente fórmula: (suma de núcleos positivos para PI para el punto de tiempo - suma de núcleos positivos para PI en t0h)/(suma de núcleos positivos para PI en t0h).

Las imágenes fueron adquiridas utilizando el sistema Opera Phenix. Las células se tiñeron en placas de visualización con fondo de vidrio de 96 pocillos o en placas de 96 pocillos con fondo de olefina y se tomaron imágenes con un objetivo de inmersión en agua de 63 × 1,15 NA. La segmentación se realizó utilizando el software Harmony. La señal DAPI de un solo plano z se detectó usando el bloque de construcción 'Buscar núcleos', el siguiente bloque de construcción 'Buscar puntos' se usó para realizar la segmentación bacteriana. La asociación Gal3 se calculó manualmente; Se analizaron cinco campos con más de 100 células para cada condición. Para cuantificar la asociación de LC3B y LC3-TVS con Mtb, se adquirieron imágenes utilizando un microscopio confocal invertido Leica SP8 con un objetivo de inmersión en aceite de 63 × 1,4 NA. La cuantificación de la asociación de Mtb y LC3-TVS se realizó manualmente utilizando el software de código abierto ImageJ/Fiji v1.53a, y se analizaron cinco campos con más de 100 células para cada condición.

Las muestras se fijaron agregando un fijador de doble potencia (2,5 % de glutaraldehído y 8 % de formaldehído en HEPES 200 mM, pH 7,4) al medio de cultivo durante 30 min a temperatura ambiente, luego se reemplazó con glutaraldehído al 1,25 % y 4 % de formaldehído en HEPES 200 mM durante la noche a 4 °C. Las muestras se procesaron en un Biowave Pro (Pelco) con uso de energía de microondas y vacío. Brevemente, las células se lavaron dos veces en HEPES (Sigma-Aldrich H0887) y se fijaron posteriormente con una mezcla de tetróxido de osmio al 2 % (Taab O011) y ferricianuro de potasio al 1,5 % (Taab, P018) (v/v). Las muestras se lavaron con agua destilada cuatro veces y se tiñeron con acetato de uranilo acuoso al 2% (Agar Scientific AGR1260A), luego se lavaron como antes. Las muestras se deshidrataron utilizando una serie gradual de etanol al 50 %, 75 %, 90 % y 100 %, luego se extrajeron del plástico de cultivo de tejido con óxido de propileno, se lavaron cuatro veces en acetona seca y se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Las muestras se infiltraron con una serie de diluciones del 50 %, 75 % y 100 % de resina epoxi de baja viscosidad (EMS) Ultra Bed en una mezcla de acetona y se centrifugaron a 600 g entre cambios. Finalmente, las muestras fueron curadas por un mínimo de 48 h a 60 °C.

Las secciones ultrafinas (~60 nm) se cortaron con un ultramicrótomo EM UC7 (Leica Microsystems) utilizando un cuchillo de diamante ultrasónico oscilante de 35° (DiaTOME) a ​​una velocidad de corte de 0,6 mm s−1, una frecuencia establecida en modo automático y un voltaje de 6,0 V. Las imágenes se adquirieron utilizando un VTEM 120k 1400FLASH con una cámara CCD Matataki.

Análisis estereológico de células infectadas con Mtb: se obtuvieron imágenes de al menos 33 células infectadas diferentes por grupo con un aumento de ×3900 mediante muestreo sistemático y aleatorio. Se contaron los puntos de cruce de la cuadrícula de prueba estereológica sobre las bacterias con respecto a la localización subcelular de las bacterias, que se determinó a partir de imágenes tomadas con un aumento mínimo de ×16 000. Se siguieron los siguientes criterios para la evaluación de la afectación de la membrana subcelular: (1) membrana circundante única, es decir, las bacterias estaban, al menos parcialmente, estrechamente revestidas por una bicapa de fosfolípidos, que representa la membrana fagosómica; (2) citosólico, es decir, las bacterias estaban rodeadas de ribosomas, que representaban el citoplasma sin indicación de la membrana fagosómica; (3) múltiples membranas circundantes, es decir, las bacterias estaban envueltas por estructuras de membrana doble o múltiple.

Las células se infectaron con Mtb WT o ΔesxBA a una MOI de 1 como se describió anteriormente. Las células infectadas se lavaron una vez con PBS y se tiñeron con medio que contenía LysoTracker Green DND-26 200 nM (LTR; Invitrogen, L7526) y NucBlue ReadyProbes Reagent (Invitrogen, R37605) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La segmentación y el análisis se realizaron usando el software Harmony como se indicó anteriormente. La señal DAPI de un solo plano z se detectó utilizando el bloque de construcción 'Buscar región de imagen', luego se usó el bloque de construcción 'Buscar puntos' para realizar la segmentación bacteriana. Cada región de interés individual se transformó en una máscara y se amplió mediante el uso del bloque de construcción "Buscar regiones circundantes" con un umbral individual de 0,8 e incluyendo la región de entrada. Esta máscara se utilizó para determinar la intensidad media de LTR asociada a cada región de Mtb. Se calculó la intensidad media de LTR asociada a cada Mtb y se importó a RStudio la media de cada punto de tiempo y condición. Luego, los resultados se exportaron como un archivo .csv.

El análisis del indicador de pH/cloruro que expresa Mtb (rv2390::mWasabi, pMSP12::E2-Crimson) se realizó utilizando el software Harmony. La segmentación y el análisis se realizaron en proyección máxima de planos z individuales con una distancia aproximada de 0,5 µm. La señal DAPI de todos los planos z se detectó utilizando los bloques de construcción 'Buscar núcleos' y 'Buscar citoplasma' para realizar con precisión la segmentación celular. Las señales de los canales mWasabi y E2-Crimson se detectaron utilizando el bloque de construcción "Buscar región de imagen" o, alternativamente, el bloque de construcción "Buscar punto", donde se aplicó un umbral manual para definir con precisión los objetos bacterianos. La señal de los canales mWasabi y E2-Crimson se fusionó usando 'Calcular imagen' y la función 'Por fórmula' aplicando una operación de canal A + B. Para cada objeto bacteriano, la intensidad de fluorescencia media de mWasabi y E2-Crimson se determinó con el bloque de construcción de propiedades de intensidad de cálculo. La actividad informadora para cada objeto bacteriano se calculó generando una salida de fórmula de la intensidad media de mWasabi por objeto sobre la intensidad media de E2-Crimson por objeto. Luego, la media de cada condición se exportó como un archivo .csv.

Todos los gráficos se produjeron y el análisis estadístico se realizó en GraphPad Prism versión 9.4.0 (GraphPad Software LLC). Las figuras se compilaron utilizando Adobe Illustrator 2022 Versión 26.2.1 (Adobe).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento. Todos los demás datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Todos los análisis se realizaron de forma reproducible utilizando scripts R disponibles públicamente.

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Agradecemos a Human Embryonic Stem Cell Unit, Electron Microscopy STP y Advanced Light Microscopy STP por su apoyo en varios aspectos del trabajo. Agradecemos a C. Bourges y J. Lee (The Francis Crick Institute) por su ayuda con la nucleofección de células primarias. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Francis Crick (para MGG), que recibe su financiación principal de Cancer Research UK (FC001092), el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (FC001092) y Wellcome Trust (FC001092). Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención número 772022). A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de este envío. CB ha recibido financiación de la Sociedad Respiratoria Europea y el programa de investigación e innovación H2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Sklodowska-Curie número 713406. PS cuenta con el apoyo de una beca FEBS a largo plazo no remunerada y ha recibido financiación de la Unión Europea Programa de investigación e innovación H2020 bajo el acuerdo de subvención Marie Sklodowska-Curie SpaTime_AnTB número 892859.

Elliott M. Bernard

Dirección actual: Departamento de Inmunobiología, Universidad de Lausana, Epalinges, Suiza

pierre santucci

Dirección actual: Universidad de Aix-Marseille, CNRS, LISM, Marsella, Francia

Estos autores contribuyeron igualmente: Beren Aylan, Elliott M. Bernard, Enrica Pellegrino.

Interacciones huésped-patógeno en el Laboratorio de Tuberculosis, Instituto Francis Crick, Londres, Reino Unido

Beren Aylan, Elliott M. Bernard, Enrica Pellegrino, Laure Botella, Antony Fearns, Natalia Athanasiadi, Claudio Bussi, Pierre Santucci & Maximiliano G. Gutierrez

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MGG concibió el proyecto y fue el principal supervisor del estudio. BA, EMB y EP realizaron experimentos y analizaron los datos. LB generó y caracterizó todas las cepas de Mtb utilizadas en este trabajo. AF realizó el análisis de microscopía electrónica. NA, CB y PS contribuyeron con el cultivo de células madre y la producción de macrófagos. MGG escribió el borrador inicial y BA preparó las cifras. BA, EMB y EP revisaron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondence to Maximiliano G. Gutierrez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a Maziar Divangahi y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Representación esquemática de la estrategia ATG7-/- CRISPR. Los círculos marrones muestran la orientación de la secuencia PAM y las líneas verdes indican los sgRNA utilizados para apuntar a los intrones que flanquean el exón 2 y el exón 3 de ATG7. Las flechas negras muestran el cebador (GF2 y GR2) utilizado para genotipificar los clones individuales después de la selección. b, c, Western blot representativo de LC3B, p62 y ATG7 en ATG7+/+, ATG7-/- iPSC (b) e iPSDM (c) después de la inanición en presencia o ausencia de BafA1 100 nM, BafA1 100 nM solo o 50 µM monensina durante 2 h. d, Representación esquemática de la orientación de la estrategia CRISPR ATG14-/-. Los círculos marrones muestran la orientación de la secuencia PAM y las líneas verdes indican los sgRNA utilizados para apuntar al intrón que flanquea el exón 5 de ATG14. Las flechas negras muestran los cebadores (GF1 y GR1) utilizados para genotipificar los clones individuales después de la selección. e,f, Western blot representativo de LC3B, p62 y ATG14 en ATG14+/+, ATG14-/- iPSC (e) e iPSDM (f) después de la inanición en presencia o ausencia de BafA1 100 nM, BafA1 100 nM solo o 50 µM monensina durante 2 h. Transferencias Western representativas de tres réplicas biológicas independientes (n = 3).

Datos fuente

Caracterización por citometría de flujo de monocitos y macrófagos WT, ATG14 y ATG7 KO. El nombre de los marcadores se indica en la parte superior de cada columna de gráficos y el genotipo de las células se indica al comienzo de cada fila. El rosa representa el control de isotipo y el azul el marcador correspondiente.

Datos fuente

a, el gráfico de la izquierda muestra el análisis cuantitativo del área de Mtb WT o DesxBA en ATG7-/- o ATG7+/+ iPSDM 2 h después de la infección. El gráfico de la derecha muestra el porcentaje de células infectadas a las 2, 24, 48, 72 y 96 h después de la infección de la misma réplica biológica. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± SEM. (b) El gráfico de la izquierda representa la cuantificación del área de Mtb WT o DcpsA en ATG7-/- o ATG7+/+ iPSDM 2 h después de la infección. El gráfico de la derecha muestra el porcentaje de células infectadas a las 2, 24, 48, 72 y 96 h después de la infección de la misma réplica biológica. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± SEM. ( c ) Análisis de transferencia Western de los niveles de ATG7, p62 y LC3B en ATG7+/+ y ATG7-/- iPSDM a las 2 h, 24 h o 48 h de infección con Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA. Transferencias Western representativas de dos réplicas biológicas independientes (n = 2).

Datos fuente

a, iPSDM se infectaron con Mtb WT, DcpsA o DcpsA:cpsA durante 2 h, 24 h y 48 h y se tiñeron para p40 Phox mediante inmunofluorescencia indirecta. Imágenes representativas del reclutamiento de p40 Phox para cada cepa, en los puntos de tiempo indicados. Las imágenes son representativas de tres réplicas biológicas independientes. Barras de escala: 10 µm. b, Análisis cuantitativo del reclutamiento de p40 Phox a WT Mtb, DcpsA o DcpsA:cpsA. Los datos son la media ± DE de tres réplicas biológicas independientes. Se siguió ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Šídák *p < 0.033, ns = no significativo.

Datos fuente

a, el gráfico de la izquierda muestra el análisis cuantitativo del área de Mtb WT o DesxBA en ATG14-/- o ATG14+/+ iPSDM 2 h después de la infección. El gráfico de la derecha muestra el porcentaje de células infectadas a las 2, 24, 48, 72 y 96 h después de la infección de la misma réplica biológica. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± SEM. (b) El gráfico de la izquierda representa la cuantificación del área de Mtb WT o DcpsA en ATG14-/- o ATG14+/+ iPSDM 2 h después de la infección. El gráfico de la derecha muestra el porcentaje de células infectadas a las 2, 24, 48, 72 y 96 h después de la infección de la misma réplica biológica. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± SEM. ( c ) Análisis de transferencia Western de los niveles de ATG14, p62 y LC3B en ATG14+/+ y ATG14-/- iPSDM a las 2 h, 24 h o 48 h de infección con Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA. Transferencias Western representativas de tres réplicas biológicas independientes (n = 3).

Datos fuente

a, Imágenes representativas de la localización endógena de Gal-3 en ATG7+/+ o ATG7-/- iPSDM infectado con Mtb WT, Mtb ΔesxBA o Mtb ΔcpsA. Las imágenes muestran tinción nuclear (azul), GAL3 (verde) y Mtb E2-Crimson (rojo). Barras de escala: 10 µm. b, Cuantificación manual de la asociación de Gal-3 con Mtb WT, Mtb ΔesxBA o Mtb ΔcpsA después de 2 h, 24 h o 48 h de infección. Datos recopilados de 3 experimentos independientes. Los resultados se muestran como media ± SEM. ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Šídák ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05, ns = no significativo. c, Imágenes representativas de ATG7+/+ o ATG7-/- iPSDM infectados con Mtb WT y Mtb ΔesxBA teñidos con LysoTracker y NucBlue y con imágenes en modo vivo después de 2 h y 24 h de infección mediante imágenes de alto contenido. Las imágenes muestran tinción nuclear (azul), LysoTracker (verde) y Mtb E2-Crimson (rojo). Barras de escala: 10 µm. d, análisis cuantitativo de la asociación LTR con Mtb como intensidad de fluorescencia media. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes). Los resultados se muestran como media ± SEM. ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Šídák, ns = no significativo. e, Imágenes representativas de ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM infectado con cepas Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA que expresan rv2390::mWasabi, pMSP12::E2-Crimson reporter en presencia de BafA1 100 nM a las 48 h de la infección. f, el análisis cuantitativo de la actividad del promotor rv2390 en las cepas Mtb WT, ΔesxBA o ΔcpsA en los puntos de tiempo indicados de infección con ATG14+/+ o ATG14-/- iPSDM en presencia de BafA1 100 nM se calculó como el cambio de veces de mWasabi MFI sobre E2 -Crimson MFI para un solo evento bacteriano. Datos representativos de uno de dos experimentos independientes (n = 3 pocillos independientes).

Datos fuente

Leyenda del video complementario 1 y tablas 1–4.

Imágenes en vivo de la replicación de Mtb en WT y ATG14 KO iPSDM: las imágenes se realizaron utilizando el microscopio OPERA Phenix con un objetivo de inmersión en agua de 40 × 1.1 NA con una superposición del 10 % entre los campos adyacentes. Se controló la proyección máxima de cinco planos con una distancia de 1 µm desde un solo campo de visión cada 1,5 h durante 96 h. Para obtener imágenes en Opera Phenix, el campo claro se detectó usando λex = transmisión/λem = 650–760 nm, PI (rojo) se detectó usando λex = 561 nm/λem = 570–630 nm y se detectó E2-Crimson Mtb (verde) usando λex = 640 nm/λem = 650–760 nm usando una cámara scMOS de 16 bits.

Western blot sin procesar.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Western blot sin procesar.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Western blot sin procesar.

Datos de citometría de flujo.

Fuente de datos estadísticos.

Western blot sin procesar.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Western blot sin procesar.

Fuente de datos estadísticos.

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Reimpresiones y permisos

Aylan, B., Bernard, EM, Pellegrino, E. et al. ATG7 y ATG14 restringen la replicación citosólica y fagosomal de Mycobacterium tuberculosis en macrófagos humanos. Nat Microbiol 8, 803–818 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01335-9

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Recibido: 24 enero 2022

Aceptado: 24 de enero de 2023

Publicado: 23 de marzo de 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01335-9

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Microbiología de la naturaleza (2023)